荧光光度法测定样品中核黄素的含量.ppt

日立F-4500荧光分光光度计的使用（第一次训练）
荧光激发光谱和发射光谱的制作（第一次训练）
工作曲线法（巩固训练）一、实验目的
二、实验原理
三、实验步骤
四、结果处理
五、思考题
六、实验延伸一、实验目的常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。

发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。荧光分析法a.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。
b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。
c.所需试样量少、操作方法简便。荧光分析仪器荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：
a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；
b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。
光源的要求：光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。检测器样品池：四面透光，石英玻璃制[O]1．日立F-4500型荧光光度计及其附件。
2．容量瓶：50mL。
3．维生素B2标准贮备液（20g·mL-1）：准确称取20mg维生素B2，用1/10(v/v)的醋酸定容至1000mL容量瓶中，保存于冰箱中。
醋酸：1/10(v/v)。1．绘制工作曲线
准确移取维生素B2标准溶液液0，0.50，1.50，2.50，3.50和5.00mL，分别加入6个50mL容量瓶中，用去离子水定容，摇匀，其浓度分别为0，0.20，0.60，1.00，1.40，2.00g·mL-1。3．维生素B2的激发光谱和发射光谱的绘制
激发光谱的制作:按仪器的使用方法准备好仪器。待仪器稳定后，将2.00g·mL-1的维生素B2标准溶液润洗样品池，然后装入溶液，放入仪器中，首先固定荧光的发射波长（400nm~600nm），然后扫描激发光波长，以所测得的该发射波长下的荧光强度对激发光波长作图，即可得到荧光化合物的激发光谱，从光谱中可以得到最大激发波长。发射光谱的制作固定荧光的激发波长为，扫描发射单色器，然后记录发射荧光强度，以所测得的各波长荧光强度对发射波长作图，即可得发射光谱，从光谱中可以得到最大发射波长
以为激发波长，以为荧光发射波长，分别测定标准系列溶液和样品溶液的荧光强度。1．列表记录各项实验数据。
2．以荧光强度为纵坐标，标准系列溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
3．根据样品溶液的荧光强度，在标准曲线上查得对应的浓度Cx，然后计算样品中维生素B2的百分含量。1．激发波长与荧光波长有何关系？为什么？
2．测定过程中应注意哪些问题？六、实验延伸参考文献