FOLIN-酚法测定蛋白质的浓度.doc

山东大学生化实验报告
题目：Folin-酚法测定蛋白质的浓度
姓名xx班级11级生科四班201100140120同组者xx
【实验原理】
蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。
【仪器与试剂】
7220分光光度计、试管、移液枪
Folin-酚试剂A：碱性铜溶液
甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中
乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。
临用时按甲：乙=50：1混合使用。
Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。
标准酪蛋白200mg/ml
未知浓度的血清蛋白
【实验步骤】
标准蛋白液及样液蛋白浓度测定。
取9支干燥洁净的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。
Folin酚法测定蛋白质浓度——标准曲线的绘制
试管编号123456789标准蛋白00.20.40.60.81.0///血清//////0.20.20.2水10.80.60.40.200.80.80.8Folin甲5ml混匀30℃水浴10min乙液0.5ml混匀30℃水浴10min640nmOD00.0810.1490.2140.2680.2970.1880.1870.187
蛋白质浓度0.000.020.040.060.080.10OD640nm00.0810.1490.2140.2680.297

【实验结果】

【实验分析及思考】
1、试说明Folin-酚法的优缺点
该方法较双缩脲法反应灵敏，使用很广泛，但花费时间长，其干扰因素较多。
2、Folin-酚试剂法测定蛋白质含量为什么比双缩脲法灵敏？
此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚B试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
Folin—酚试剂由A试剂和B试剂组成。A试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。B试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。
由此可见是它们的显色灵敏度不同造成的。
3、Folin酚法测蛋白质含量为什么要求加入乙试剂后立即混匀？
第一步相当于双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物；第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物(呈蓝色反应)，因此需要快速混匀,继续实验
从曲线中可以看出，反应后溶液的吸光度大致与其浓度成正比例关系。在图中找到血清的平均吸光度的点，其横坐标即为稀释后的血清中蛋白的含量。
用酪蛋白测定血清蛋白有无误差？
答：有。从实验原理中可以得知，蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法测定蛋白质浓度。即最终用比色法测得的结果与蛋白质（多肽）中酪氨酸与色氨酸的含量成正比例关系。因酪蛋白中酪氨酸与色氨酸的含量与卵清蛋白中不同，故实验结果存在误差。另外，因等质量的酪蛋白中酪氨酸与色氨酸的总含量明显高于卵清蛋白。故用酪氨酸实验最终绘制的蛋白标准曲线其纵坐标较用卵清蛋白为实验试剂所绘标准蛋白曲线纵坐标高。此结果直接导致血清中蛋白含量的测定值较实际值低。