药用植物黄芪组织中DNA的提取与纯化.doc

实验一DNA提取液的配制
试验目的
1明确提取液的配制原理
2通过对提取液的配制，掌握提取液中各试剂在提取中的作用。
实验原理
DNA是遗传物质,植物DNA的提取是植物基因工程的基础。通常要求所提取的DNA要有理想的纯度,足够完整,无断裂降解,提取过程尽量少使用有毒化学品等。为了达到上述要求,已报道了不少提取植物DNA的方法,归纳起来,主要有CTAB法、SDS法和碱提取法。DNA分子是分子生物学研究的基本材料,依不同的实验目的可采取不同的抽提方法获取数量和质量不等的DNA。因此提取液里试剂的配比也有所不同：植物DNA的抽提常采用CTAB方法：
配方如下：
1配制提取液之前，先配制母液。
母液（灭菌）：5MNaCl(58.4g加ddH2O制成200ml溶液)
0.5MNa2-EDTA(37.22g+ddH2O至200ml,用NaOH调pH值为8.0)
1MTris-HCl(12.11gTris-HCl+ddH2O至100ml,用浓盐酸调pH值至8.0)
2提取液配方
100ml
加入：CTAB粉剂2g
1MTris(pH8.0)10ml
0.5MEDTA(pH8.0)4ml
5MNaCl28ml
PVP1g
β-巯基乙醇1ml
加双蒸水定容至100ml
3抽提液
分别量取苯酚、氯仿、异戊醇按25：24：1的体积比混合，再分别量取氯仿、异戊醇按24：1的体积比混合，配制成两种抽提液，各配制100ml
40.1xTE
1mlTris，20µlEDTA中加H2O,用HCl调pH至8.0,定溶，灭菌
三、实验器材
烧杯、量筒、容量瓶、玻璃棒、吸管、移液枪、离心管、冰箱、高压灭菌锅、电子天平、洗瓶
四、实验试剂
蒸馏水、CTAB、NaCl、EDTA、Tris-HCl、β-巯基乙醇、0.1xTE、RNase酶、苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇
五、作业：
1、配制DNA提取液时每一个所用试剂目的与作用。

实验二药用植物组织中DNA的提取与纯化
试验目的
学习和掌握酚----氯仿提取法从药用植物组织中提取DNA的原理与技术
实验原理
DNA是遗传物质,植物DNA的提取是植物基因工程的基础。通常要求所提取的DNA要有理想的纯度,足够完整,无断裂降解,提取过程尽量少使用有毒化学品等。为了达到上述要求,已报道了不少提取植物DNA的方法,归纳起来,主要有CTAB法、SDS法和碱提取法。DNA分子是分子生物学研究的基本材料,依不同的实验目的可采取不同的抽提方法获取数量和质量不等的DNA。植物DNA的抽提常采用两种方法：（1）SDS法；（2）CTAB法。
CTAB法简便、快速,DNA产量高(纯度稍次,适用于一般分子生物学操作)。CTAB是一种非离子去污剂,也是一种阳离子表面活性剂。它既可以裂解细胞,又可以与DNA形成复合物而溶于高盐溶液中。当盐浓度降低时,此复合物将析出,同时CTAB可有效沉淀多糖。通过液氮研磨粉碎植物组织，裂解液裂解细胞，有机溶剂抽提，弃除样品中的蛋白质、脂肪、多糖及其它次生代谢物，及DNA提取过程中加入的饱和酚，氯仿－异戊醇（24：1）等，得到纯度较高的DNA样品。
实验器材
药材、恒温水浴箱、高速冷冻离心机、移液器、离心管、超低温冰箱、
实验试剂
液氮、3﹪CTAB、1.4mol/LNaCl、20mmol/LEDTA、100mmol/LTris-HCl、0.5﹪PVP、500µlβ-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇氯仿/异戊醇（24：1），70%酒精；RNA酶；
实验操作
（1）称取黄芪干燥根0.2g,在液氮中研磨成粉末状;将粉末转入1.5ml离心管中，并做好标记；
（2）迅速加入1.5ml65℃预热的CTAB提取缓冲液（使用前加入500µlβ-巯基乙醇），快速混匀，65℃恒温水浴40分钟以上，期间每隔10min颠倒轻摇一次；（3）取出冷却至室温后，10000rpm离心5min，取上清液加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25/24/1，V/V/V），缓慢翻转离心管使之混匀成乳浊液，12000rpm离心5min；
（4）取出上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇（24/1，V/V），混匀后12000rpm离心5min；
（5）取上清后，重复步骤（4）；
（6）取上清液，加入2.5倍体积冷冻的无水乙醇，置于–20℃条件下半小时；（7）8000rpm离心5min，弃上清液，加入700µl70﹪乙醇，室温下漂洗1小时；重复一次步骤（7），
（8）然后8000rpm离心5min，弃上清液，室温下晾干。最后加入100µlTE（0.1m）溶解过夜；将溶解好的DNA，放入-20℃冰箱保存待用。
六、注意防止核酸的降解的措施和操作过程中的注意事项。
裂解液要预热（65℃），以抑制Dnase,加速蛋白变性，促进DNA溶解。
酚一定要碱平衡。
各操作步骤要轻柔，