叶绿素含量的测定.doc

叶绿素含量的测定

实验目的
了解分光光度计的工作原理；
掌握不同型号分光光度计的操作方计；
通过本实验的学习掌握叶绿素含量测定的一种常见的方法------分光光度法。
实验原理
叶绿素是脂溶性色素，主要存在于以叶绿体为首的色素体中。在活体中，叶绿素与脂蛋白结合并受到还原系统的保护，对氧和光是稳定的。
叶绿素的80%丙酮提取液在波长663nm，645nm有吸收峰，叶绿素a和叶绿素b的浓度符合以下公式：
Ca=0.0127A663-0.00259A645
Cb=0.0229A645-0.00467A663浓度单位是：g/L

Ca=12.7A663-2.59A645
Cb=22.9A645-4.67A663浓度单位是：mg/L

叶绿素总浓度为：CT=Ca+Cb
若以试液中色素含量来表示，则

仪器、试剂和材料
仪器
紫外-可见分光光度计、研体、25ml容量瓶、玻璃漏斗、玻璃棒、皮头滴管
2.试剂
丙酮（分析纯）、85%丙酮、80%丙酮
材料
滤纸、石英砂、碳酸镁
四、操作步骤
1.在遮光条件下取出等测样品，剪碎，混匀，称取鲜样0.1-0.5g；
2.样品置于研钵内，加入少量碳酸镁和石英砂，加入一定体积的丙酮研磨匀浆，再加85%丙酮适量继续研磨至组织白色；
3.经铺有滤纸的漏斗将匀浆液转入25ml的容量瓶中，并用80%的丙酮分次清洗研钵和滤纸，最后用80%的丙酮定容。
4.以80%的丙酮为参比液，在663和645nm波长处测定吸光值（A应在0.2-0.8范围内，浓度过大应用80%丙酮适当稀释）。
五、结果处理
按照公式计算出叶绿素a和叶绿素b的浓度，再计算出叶绿素的含量。
六、注意事项
1.在活体内，结合态叶绿素是稳定的，组织一经破坏，叶绿素易被光解。因此，抽提和测定工作应尽可能避光快速完成。
2.对含有大量酸性液泡的样品，应首先加入微碱性的缓冲液，仔细研磨后加入丙酮进行抽提。
3.分光光度计的精度对测定的结果有至关重要的影响，使用前对仪器进行校正。
七、思考题
1.当溶液中有两种成分共存时，利用分光光度计进行测定时，如何选择测定波长？

附属实验：
溶剂极性对有机物精细结构影响
苯-环己烷、苯-乙醇、苯-水
溶剂pH对光谱的影响
苯酚、苯酚—H+（pH=6）、苯酚—OH-（pH=10）