心肌细胞培养纯化与小鼠骨髓间充质干细胞分化诱导的研究.doc

心肌细胞培养纯化与小鼠骨髓间充质干细胞分化诱导的研究（完整版）实用资料
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佳木斯大学
硕士学位论文
心肌细胞培养纯化与小鼠骨髓间充质干细胞分化诱导的研究
姓名:邵华
申请学位级别:硕士
专业:病理学与病理生理学
指导教师:金秀东;王淑秋
20070420
佳本颧大学硕士研究生论文
BMSCs5.BrdUCMGANPBNPSCFMPCMAPCAMI
b.FGFVEGFANG.1HGFDMSOcnlTFCSPVPPEGHEGGJIC英文缩写
骨髓间充质干细胞
5.溴脱氧尿苷
心肌原性细胞系
心房利钠多肽
脑钠素
干细胞因子
问质祖细胞
多潜能的间质干细胞
急性心肌梗死模型
碱性成纤维细胞生长因子
血管内皮生长因子
血管紧张素一l
肝细胞生长因子
二甲基亚砜
心肌肌钙蛋白T
胎牛血清
聚乙烯吡咯烷酮
聚乙二醇
羟乙基淀粉
细胞间隙连接

佳本斯大学硕士研究生论文
中文摘要
目的:探讨心肌细胞分离、纯化和培养方法;研究骨髓间充质干细胞(BMSCs在不同心肌细胞微环境作用下,向心肌样细胞分化能力。
方法:采用不同时间点,通过差速贴壁纯化、培养新生乳鼠心肌细胞。将原代乳鼠心肌细胞与BMSCs联合培养,分为:接触性联合培养组,将心肌细胞与BMSCs
按2:1的比例种植在同一培养皿中;非接触性联合培养组,将分别种植有心肌细胞、
BMSCs的盖玻片按2:1的比例种放入同一培养皿中共同培养;对照组,BMSCs常
规培养。二周后检测各实验组细胞中,心肌特异性蛋白肌钙蛋白T(cTnT表达情况。
结果:心肌细胞培养,采用差速贴壁60min组与90min组之间有统计学意义,差速贴壁60min组、90ram组与差速贴壁120IIlin组两两之间有统计学差别。免疫细
胞化学鉴定:(1接触性联合培养组细胞均表达肌钙蛋白T(cTnD:(2非接触性联
合培养组细胞均表达肌钙蛋白T(cTnD;(3对照组细胞不表达肌钙蛋白T(cTnT。
结论:心肌细胞培养过程中,采用差速贴壁60min较差速贴壁90mm、120lIliIl获得的心肌细胞数量高;接触性联合培养组与非接触性联合培养组均可将BMSCs诱
导分化为心肌样细胞,对照组BMSCs无分化。
关键词:心肌细胞;培养;骨髓间充质干细胞;诱导;分化

前言
在我国,缺血性心肌病发病率逐年提高,一般认为心肌细胞是终末分化细胞,出生后即失去分裂能力,心肌细胞一旦损伤坏死,只能由纤维组织代替形成瘢痕,导致
心脏的收缩舒张功能障碍,以致发生左室重构,造成顽固性心力衰竭乃至死亡…。目
前心肌梗死的I临床治疗手段均不能使坏死的心肌再生,故对大面积心梗病人疗效甚
差。心肌细胞移植是近年发展的治疗心肌梗死的一种新方法。但是,理想的供体细胞
必须满足3个条件:(1自体来源:(2体外增殖能力强,无恶变;(3移植后与宿
主细胞形生闰盘连接,产生有效的电.机械偶联12】。
骨髓干细胞是成体干细胞的一种,包括造血干细胞和骨髓间质干细胞(mesenchymalsterncells,MSCs,后者来源于中胚层的间充质,是胚胎发育过程中少
量原始间充质细胞迁移填充组织间隙时定居骨髓腔而来,又称为骨髓问充质干细胞
(bonemesenchymalstemcells,BMSCs。随着干细胞研究的广泛开展和深入,BMSCs
被称为是组织工程中最具有应用前景的一种干细胞,其原因在于:(1BMSCs具有
自我更新和向多种外胚层和中胚层来源的组织细胞横向分化的潜能,在一定条件下可
以分化为成骨细胞、成肌细胞、成软骨细胞等;(2BMSCs数量相对稳定,在生命
过程中长期存在;(3BMSCs在体外培养时具有易于粘附的特点而易于分离,并且
在体外经过长期培养和冻存后不会改变其分化潜能;(4BMSCs取材容易,能够进
行自体移植,不存在免疫排斥反应;避免了胚胎干细胞进行组织代替治疗中所面临的
一系列伦理问题131。近年来研究表明BMSCs在适宜的环境能够分化为心肌细胞。将
BMSCs移植至缺血心肌中可分化为心肌细胞,增加有功能心肌细胞数量,改善心肌
功能。因此BMSCs是治疗心肌梗死的理想种子细胞,具有广阔的应用前景。
目前体外诱导BMSCs分化为心肌细胞的方法有多种。本实验通过体外分离、纯化、培养心肌细胞,一方面探索更为适宜的心肌细胞培养方法,观察心肌细胞在体外
形态及搏动情况;另一方面研究心肌细胞在体外对BMSCs定向诱导分化作用,进一
步证实BMSCs具有向心肌细胞分化的潜能,并分析BMSCs诱导分化的机制。

快不等,慢的lmin仅数次,快的可达200rfmin以上。一般乳鼠心肌细胞搏动在120
r/min左右达到生理状态。心肌细胞的搏动时间长的可维持90天,甚至更长。
(三心肌细胞的分离、纯化、培养
心肌细胞