发酵工艺优化及发酵液后处理的研究.pdf

内蒙古农业大学

硕士学位论文

乳糖酶基因在毕赤酵母中的表达鉴定、发酵工艺优化及发酵液
后处理的研究

姓名：苏全

申请学位级别：硕士

专业：预防兽医学

指导教师：周雨霞;张伟

20070501
摘要13-D．半乳糖苷半乳糖水解酶(B．D—galactoside通常被称为乳糖酶①actase)。该酶可将乳糖水解成为半乳糖与葡萄糖，同时也具有半乳糖苷的转移作用。B．半乳糖苷酶主要应用在生产低乳糖乳制品以及缓解绝大多数亚洲人食用乳制品时造成的乳糖吸收不良和乳糖不耐受的问题。但目前在我国乳糖酶的应用还未得到广泛推广，主要原因就是乳糖酶产量低，销售价格过高，应用成本昂贵，不能满足食品和乳制品工业的需要。而基因工程技术的发展，为研制出产量高、酶学性质优良、工艺简便、成本低、更适合食品工业生产的乳糖酶提供了有效的途径。本试验利用基因工程技术，构建真核表达载体ppIC9．cDNA，并且利用毕赤酵母表达系统成功的高效分泌表达了来源于亮白曲霉的乳糖酶，表达量达6s：L。在此基础上对高表达菌株的插入位点进行了鉴定，结果显示1’、7。初步认为整合方式相同，并且与25。整合方式不同，这为寻找高表达的菌株与插入位点之间的关系，为获得高表达菌株奠定理论基础。同时在小试水平对乳糖酶的发酵工艺进行了研究和优化，成功的摸索出乳糖酶发酵的最佳条件为lO％接种量，温度30"(2，pH5．2，菌体生长时间24～28h，甲醇添加量由DO控制，诱导方式首先采取了葡萄糖一甲醇混合物进行过渡期，随后是甲醇诱导的方式，这将为乳糖酶大规模工业化生产提供借鉴。最后，根据乳糖酶发酵液中颜色较深，盐浓度高等特点和后期纯化工艺的要求，选择了膜分离技术来处理发酵液，其中主要从微滤提取、超滤浓缩两步操作过程对酶活性的影响进行了研究，就超滤而言，温度25℃，操作压力小于0．12MPa，浓缩倍数lO倍时，酶活损失最少，膜最容易清洗。关键词：乳糖酶；巴斯德毕赤酵母；聚合酶链式反应；Southern印迹杂交；发酵；膜技术3．2．1．23)galactohydrolase,EC
ins硎∞site．si蛐licantanddownstreamExpressionIdentifyofLacinPichiaStudiesitsFermentationStrategyOptimizationtheDownstreamliquorsp-D-galaetosidegluco∞，andc蛆beappnedengineeringhighgenerally#veslookingWeinduduringPastorisProcessgalactohydrolase伍Cintolerance'’．Mainl,wtase．eukaryote,Hchiafolding,andfaster,easier,andlevels．Toexperimentation,Thereportedl”、尹hadestablishedexpressedcreatedconclusion,Exploratedpercent，TMgrowthaddedinducedced缶sⅡyperiod，thenfollowedofglucose-methanolofmembranereviewed．Inmembraneme!Ⅱlbrane．To3,2．1．23)isnamedgalactoside．Lactageproducinglactageof“lactoseloweffectiveforquality，simplesuchprocessing,proteinbeing鹊easyEuseotherdate,proteinbeensecretedrecombinant6mg／mLfermenter，ofrecombinantsamedifferentcompared254．tlliSnewmethodfermentlactage．Inoflactageamount30"C，pH5．2。thefinehours，themethanolDO，theWagofGlucosedemethanol,thefurtheroflactasepaper,wenipulationparametersonusuallylactasewhichhydrolyzelactoseintogalactosealsotransferismainlyuseddairyproducts，alsotreatmentproblemsproductionyield，high-costnarrowrange．Thedevelopmentgenetictechnologysuppliesapproachyield，highcraft,lowThisstudyusingeukaryof