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(完整word版)微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏实验

实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏

一、实验目的和要求

1。了解微生物的分离纯化方法。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
3。学习微生物的保藏及鉴定方法。
4。熟悉革兰氏染
二、实验原理

多管发酵法
多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖蛋白胨
液体培养基，并倒置一德汉氏小套管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠
菌群能发酵乳糖而产酸产气.
1.初发酵试验
水样接种于发酵管内，37℃下培养,24小时内小套管中有气体形成,并且培养基混浊，颜色
改变，说明水中存在大肠菌群,为阳性结果。48小时后仍不产气的为阴性结果。
2。平板分离
初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美
蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
3.复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落,经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证
实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材及试剂

1。水样

污水样本

2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂

（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。

3、器材及耗材：双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外

线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑

料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等

四、实验方法及步骤

1。第一天
实验前的准备
1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL,并加入产气管.配置营养琼脂培养基，灌装进
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2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥
箱。
2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。于121℃高压灭菌锅中灭
菌20分钟。
3）称取一定量的液体石蜡,约为锥形瓶的三分之一。于121℃高温高压灭菌20分钟。
4）称取1。8克氯化钠，溶于200mL水中，于121℃高温高压灭菌20分钟。

2。第二天
1)将3支试管根据取样地的不同贴好标签，写好姓名学号，在取样处现场在每支试管中滴
加3-4滴水样，37℃培养24小时。
3.第三天
1）取出培养过的水样,取产气最多的一支备用。

2）从试管中取1mL加入到9mL无菌水中,再依次稀释100、1000直至100000倍。

3）将5个梯度的稀释样以划线分离法和平板涂布法接在培养基的表面，于37℃培养24小

时。

4.第四天

挑取颜色较深的菌落

1)制片：取一块干净的载玻片，各靠一小滴无菌水，以无菌操作规程分别挑取大肠杆菌和

枯草杆菌少量，涂布于对应的载玻片上与无菌水混匀,涂成极薄的菌膜.自然干燥后再通过酒精

灯进行热固定。

2）初染：于菌膜上滴加结晶紫染液，以盖满菌膜为宜，染色1-2min后倾去染液，用蒸馏

水轻轻冲洗至流下无色为止，甩去载玻片上的残余水.

3）媒染：滴加碘液染色1—2min,用蒸馏水冲洗干净.

4)脱色：滴加95％酒精液脱色30秒钟（准确计时)，用蒸馏水冲洗干净。

5)复染：滴加蕃红液染色1—2min,用蒸馏水冲洗干净最后自然干燥。

6）镜检

7）将生长良好的菌落接种在斜面培养基上，37℃培养24小时。

5.第五天

微生物的保藏
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（一）斜面低温保藏法：

此法为最常用的一种.一般霉菌；放线菌和有芽孢的细菌可保存2～4个月，酵母菌可保存2

个月，无芽孢的细菌最好每周移接一次。操作过程如下:

1）接种：将要保藏的菌种接入斜面培养基上，试管上贴好标签，写上菌种名称，时间。

2）培养：各类菌按其所需温度和时间进行培养。

3)保藏：选取生长健壮的菌种,于其试管带棉塞的上半部用灭菌的牛皮纸包扎好，以防棉塞

受潮感染杂菌。置于4℃冰箱中保藏。

(二）液体石腊保藏法：

此法可用不分解石腊的菌种保藏.保存时间是半年至一年.放线菌；霉菌和产芽孢菌可保藏

二年。液体石腊可防止培养基水分的蒸发，而引起的菌种死亡。同时可阻止氧气进入，防止好

氧菌的生长。从而延长菌种保藏的时间。但需注意的是试管必须直立放置，并且不便携带。操

作过程如下：

1）液体石腊的灭菌：将液体石腊装入锥形瓶中，量不超出锥形瓶体积的1/3，塞上棉塞，

包扎好后，进行高压蒸汽灭菌二次(120℃30分钟）.再在110～120℃干燥箱中蒸发掉蒸汽灭菌

时带入的水分。此时石腊透明清