一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106754823A(43)申请公布日2017.05.31(21)申请号201611236142.3(22)申请日2016.12.28(71)申请人苏州旷世骏弛生物科技有限公司地址215500江苏省苏州市常熟经济技术开发区四海路11号(72)发明人刘喜朋(51)Int.Cl.C12N9/24(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表1页附图2页(54)发明名称一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法及其应用，本发明中制备的尿嘧啶DNA糖苷酶能够在20-37度高效水解DNA中的尿嘧啶碱基与脱氧核糖之间的糖苷键；同时其具有良好的热敏感性，当温度高于60度时其迅速失活，达到60度5分钟酶活性丧失99%；制备的热敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶可以用于防止各种核酸检测反应中的样本DNA污染。本发明的有益效果在于：在各种核酸检测反应中，热敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶清除DNA样本污染的效果非常明显，既能够完全去除污染的DNA，又对核酸扩增反应没有任何抑制作用。可以用作各种核酸扩增反应（例如PCR）的样本污染清除剂，消除前一次扩增产物所导致的DNA污染，增加核酸检测的准确度。CN106754823ACN106754823A权利要求书1/1页1.一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）构建尿嘧啶DNA糖苷酶的重组表达质粒基于嗜冷微生物基因组信息，设计合成其编码的尿嘧啶DNA糖苷酶基因，在此基础上，优化尿嘧啶DNA糖苷酶基因的稀有密码子，并将优化的尿嘧啶DNA糖苷酶基因克隆到原核表达载体pET28等，构建尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒；（2）重组表达尿嘧啶DNA糖苷酶将构建的尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行热敏感性尿嘧啶DNA糖苷酶诱导表达；（3）亲和纯化表达的尿嘧啶DNA糖苷酶离心收集诱导表达尿嘧啶DNA糖苷酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，离心收集大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化热敏感性尿嘧啶DNA糖苷酶；（4）检测尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活性和热稳定性，获得热敏感性优良的尿嘧啶DNA糖苷酶将纯化的尿嘧啶DNA糖苷酶进行酶活性和热稳定性检测，鉴定其酶活性与热稳定性；确保其能够在中低温下具有水解DNA中尿嘧啶碱基与脱氧核糖之间的糖苷键，同时当温度高于60度时其迅速失活。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述嗜冷微生物包括Colwelliapsychrerythraea等。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将热敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株培养至OD600=0.4-1.0，再加入0.5mM诱导剂IPTG在25-37℃温度下培养3小时或10-25℃温度下培养12小时进行诱导表达。4.如权利要求1～3之一所述的制备方法得到的热敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶。5.如权利要求4所述的DNA污染清除剂，其特征在于，其为热敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶，其中：尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。6.如权利要求1～3之一所述的制备方法得到的热敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶在基于PCR等的核酸检测中的应用，防止/除去上一次核酸检测反应导致的DNA污染。2CN106754823A说明书1/4页一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法及其应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法及其应用。背景技术[0002]PCR技术的出现使得体外快速制备特定DNA分子成为可能，目前广泛应用于各种核酸扩增与检测领域，极大地促进了基于核酸的分子诊断技术的发展。在基于PCR等核酸扩增技术的分子诊断中，DNA样本的交叉污染，特别是以前的检测样本对后续检测实验样本的污染，直接影响着检测反应的准确性。为了消除不同批次检测DNA样本的交叉污染，目前采用在PCR反应体系中通过添加dUTP，从而使合成的DNA中含有dU碱基，在进行下一次PCR检测反应之前，在样本中添加尿嘧啶DNA糖苷酶，使得DNA片段化来消除以前检测反应产生的DNA。然后再进行PCR扩增反应，进行新样本的检测。从以前的尿嘧啶DNA糖苷酶在高温具有较高稳定性，不容易失活，从而导致合成的DNA中的dU被水解，从而使DNA被碎片化，使扩增反应不能够有效进行，导致DNA扩增反应的产量大大降低，降低了检测灵敏度。发明内