一种复合细胞制剂、制备方法及其用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107913290A(43)申请公布日2018.04.17(21)申请号201711406164.4A61K35/16(2015.01)(22)申请日2017.12.22(71)申请人北京再生生物科技研究院有限公司地址100085北京市海淀区信息路甲28号C座02C室-460号(72)发明人张洪钿苑春慧(74)专利代理机构北京纽乐康知识产权代理事务所(普通合伙)11210代理人白明珠(51)Int.Cl.A61K35/44(2015.01)A61P3/10(2006.01)A61P9/10(2006.01)C12N5/071(2010.01)A61K35/28(2015.01)权利要求书1页说明书11页附图6页(54)发明名称一种复合细胞制剂、制备方法及其用途(57)摘要本发明公开了一种复合细胞制剂、制备方法及其用途，其包含：自体富血小板血浆PRP、自体脂肪干细胞ADSCs和ADSCs来源的内皮祖细胞EPCs，包括以下步骤：采集脂肪并分离出脂肪细胞；脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代自体ADSCs；所述P2代的ADSCs经EPCs培养基培养得到P0代ADSCs来源的EPCs；采集受者自身抗凝外周血经过离心得到PRP，以及上述复合细胞制剂在治疗由糖尿病引起的下肢动脉闭塞症药物中的应用。本发明有益效果：采用EPCs培养基诱导ADSCs培养，获得CD133表达率为68.72±11.60%，vWF表达率为75.91±9.83%的EPCs，无需采集骨髓或动员外周血，糖尿病下肢动脉闭塞症患者患部注射后能降低肢体痛感和冷感，侧支血管新生率100%；总生存率为78.12%，保肢生存率为68.00%，能够有效延长患者截肢时间。CN107913290ACN107913290A权利要求书1/1页1.一种复合细胞制剂，其特征在于，其包含：自体富血小板血浆PRP、自体脂肪干细胞ADSCs和ADSCs来源的内皮祖细胞EPCs。2.根据权利要求1所述的一种复合细胞制剂，其特征在于，以含2%CaCl2的生理盐水分别重悬ADSCs和EPCs，调整细胞密度至2x107/mL，再按体积比1：1与PRP混匀，静置20分钟，得到所述复合细胞制剂。3.制备权利要求1所述复合细胞制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.采集脂肪并分离出脂肪细胞；S2.脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代自体ADSCs；S3.所述P2代自体ADSCs经EPCs培养基培养得到P0代ADSCs来源的EPCs；S4.采集受者自身抗凝外周血经过离心得到PRP。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以ADSCs培养基重悬P2代自体ADSCs，接种至培养器皿中培养，换EPCs培养基培养6天收获P0代ADSCs来源的EPCs。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S5进一步包括如下步骤：采集受者自身抗凝外周血，离心收取上清及部分红细胞；再次离心弃去上部上清，收取中间层和红细胞层上部白膜层。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S2进一步包括如下步骤，采用腹部皮下抽脂，剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，以含硫酸庆大霉素的医用生理盐水重悬，离心取脂肪层和沉淀层，以消化液消化，经水浴和充分振荡后去悬浮絮状物，经筛网过滤，收集滤液，滤液离心弃上清，以PBS重悬，静置后吸弃悬浮物，再次离心弃上清。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S3进一步包括如下步骤，以ADSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度后接种至培养器皿中，于37℃，5%CO2培养箱内培养至70-80%汇合时收获；收获时加入胰蛋白酶溶液室温消化5分钟，加入抑肽酶溶液终止消化；离心弃上清，收获沉淀物；沉淀物经洗涤和细胞筛过滤，收集滤液；滤液离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代自体ADSCs；P0代自体ADSCs传代培养至P2代收获。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述于37℃，5%CO2培养箱内培养至70-80%汇合时收获的具体操作方法为，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80%汇合。9.根据权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于，所述ADSCs培养基为含有UltroserGserumsubstitute的UltraCULTURE；所述EPCs培养基为含有以下成分的DMEM/F12：无动物源成分血清替代品、地塞米松、重组人血管内皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1。10.权利要求1或2所述的一种复合细胞制剂在用于治疗糖尿病引起的下肢动脉闭塞症的药物中的用途。2CN107913290A说明书1/11页一种复合细胞制剂、