核酸扩增方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108504706A(43)申请公布日2018.09.07(21)申请号201810154405.9(22)申请日2018.02.23(30)优先权数据2017-0338862017.02.24JP(71)申请人希森美康株式会社地址日本兵库县(72)发明人能登谷伦崇山下秀治吉村美香前田丰(74)专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人郑天松(51)Int.Cl.C12P19/34(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表2页附图4页(54)发明名称核酸扩增方法(57)摘要本发明旨在提供可更简便地抑制遗留导致的假阳性的核酸扩增方法。本发明由核酸扩增方法解决上述的课题，其特征在于，包括以试样中所含的目标核酸作为模板而进行第一核酸扩增工序，以在上述第一核酸扩增工序中生成的扩增产物作为模板而进行第二核酸扩增工序，在第一核酸扩增工序中，使用选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶，生成不含尿嘧啶碱基的扩增产物，在第二核酸扩增工序中，使用含尿嘧啶碱基的引物及/或dUTP和能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶，生成含尿嘧啶碱基的扩增产物。CN108504706ACN108504706A权利要求书1/2页1.核酸扩增方法，其包括：以试样中所含的目标核酸作为模板而进行第一核酸扩增工序，及以在上述第一核酸扩增工序中生成的扩增产物作为模板而进行第二核酸扩增工序，其特征在于，在第一核酸扩增工序中，使用选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶而生成不含尿嘧啶碱基的扩增产物，在第二核酸扩增工序中，使用含尿嘧啶碱基的引物及/或dUTP和能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶而生成含尿嘧啶碱基的扩增产物。2.权利要求1所述的方法，其中在上述第一核酸扩增工序中，将上述试样，dATP、dTTP、dCTP及dGTP，选择性地扩增不含上述尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶混合而调制反应液，上述反应液是基本上不存在dUTP、有存在含尿嘧啶碱基的核酸的可能性的液状试样。3.权利要求1所述的方法，其中不包括分解含尿嘧啶碱基的核酸的工序。4.权利要求1所述的方法，其中在上述第二核酸扩增工序中，在dATP、dUTP、dCTP及dGTP的存在下进行核酸扩增。5.权利要求1所述的方法，其中在上述第二核酸扩增工序中，使含作为模板核酸的第一核酸扩增工序的扩增产物的水相和油混合，在油相中，制作含模板核酸、dATP、dUTP、dCTP、dGTP及能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶的水性液滴，扩增上述液滴中的模板核酸。6.权利要求1所述的方法，其中在上述第二核酸扩增工序之后，还包括检测上述第二核酸扩增工序的扩增产物的工序。7.权利要求1所述的方法，其中在上述检测工序中，使用嵌入剂或与上述第二核酸扩增工序的扩增产物特异性地结合的标记探针而进行扩增产物的检测。8.权利要求1所述的方法，其中选择性地扩增上述不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶是古细菌来源的DNA聚合酶。9.权利要求1所述的方法，其中选择性地扩增上述不含尿嘧啶的核酸的DNA聚合酶是火球菌属(Pyrococcus)来源或子宝热球菌(Thermococcuskodakaraensis)来源的耐热性DNA聚合酶。10.权利要求1所述的方法，其中上述能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶是水生热球菌(Thermococcusaquaticus)来源的耐热性DNA聚合酶。11.权利要求1所述的方法，其中选择性地扩增上述不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶是PhusionHotStartHigh-FidelityDNA聚合酶及/或KODplusneo。12.权利要求1所述的方法，其中在上述第一核酸扩增工序中，使用与上述目标核酸的第一区域结合的第一引物、和与上述目标核酸的第二区域的互补链结合的第二引物，在上述第二核酸扩增工序中，使用与上述目标核酸的第三区域结合的第三引物、和2CN108504706A权利要求书2/2页与上述目标核酸的第四区域的互补链结合的第四引物，上述第三引物及/或上述第四引物含尿嘧啶碱基，(i)上述第一区域和上述第三区域的一部分或全部重复，并且，上述第二区域和上述第四区域的一部分或全部重复，或者(ii)向上述第一及第二引物附加的标签的一部分或全部各自与第三及第四区域重复。13.权利要求1～12之任一项所述的方法，其特征在于，上述第一核酸扩增进行15～50个循环，上述第二核酸扩增进行20～60个循环。14.在权利要求1所述的方法中使用的核酸扩增用试剂，其含：选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶、dATP、dTTP、dCTP及dGTP。15.在权利要求1所述的方法中使用的核酸扩增用试剂，其含：能扩增含尿