miRNA定量方法.doc

miRNA定量PCR
1miRNA茎环反转录合成cDNA
（1）反转录引物设计：对成熟miRNA采用茎环反转录合成cDNA，在成熟miRNA的3’端使用一条50nt可自行折叠成茎环结构的特异性RT引物，序列如下：5`-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACNNNNNN-3`，3’端的6个N代表与成熟miRNA3’端反相互补的6个碱基。
（2）反应体系：在0.2mlPCR反应管中加入，总反应体系为20μL：
5×FirstStrandsynthesisBuffer4μLdNTPMix1μLRNaseInhibitor（40units/μl）1μLReverseTranscriptase（M-MLV）1μLStem-loopRTPrimer1μLTotalRNA（终浓度500ng）XμLRNase-freeddH2O补至20μLTotalvolume20μL（3）反应条件：
Stage1：将混匀的反应溶液置于65℃加热5min，之后放入冰中2min。
Stage2：放置PCR仪里16℃热激30min，之后42℃60min，85℃，5min使酶失活停止反转录。
2miRNA实时荧光定量qRT-PCR
（1）定量引物设计：反转录后cDNA产物的引物由一条特异性引物和一条通用引物组成，特异性引物基础序列于目标miRNA成熟序列互补，根据对引物的长度，Tm值及GC含量的要求再用软件进行调整，可在5’端加2-3个GC以增加退火温度，平衡GC含量，U6被作为内参序列。所有使用的引物序列被列在表3-1。
（2）应用SYBR染料法，对miRNA采用实时定量检测。反应体系参照SYBR®PremixExTaqTMⅡ（PerfectRealTime）说明书，（反应液配制均在冰上进行）。
总反应体系为25μL：
SYBR®PremixExTaqTMⅡ12.5μLSpecificForwardprimer（10μM）1μLUniversalReverseprimer（10μM）1μLcDNA1stStrand2μLddH2O8.5μLTotalvolume25μL（3）RealTimePCR反应程序：
Stage1：预变性95℃5min；
Stage2：40循环：95℃5s，60℃30s
以上循环结束后进行65℃~95℃的融解曲线分析。为确保实验数据的有效性，每个样品平行三次，溶解曲线为单一峰。按照相对定量算法，目的基因的相对表达量计算公式为：Rel.Exp=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(处理样品ΔCt)-(CalibratorqΔCt)，处理样品ΔCt=(内参基因Ct)-(目的基因Ct)，CalibratorΔCt=(参比样内参基因Ct)–(参比样目的基因Ct)[[]Varkonyi-GasicE,WuR,WoodM,WaltonEF,HellensRP.Protocol:ahighlysensitiveRT-PCRmethodfordetectionandquantificationofmicroRNAs[J].PlantMethods.2007.
,[]CaifuChen,DanaA.Ridzon,AdamJ.Broomeretal.Real-timequantificationofmicroRNAsbystem-loopRT-PCR[J].NucleicAcidsResearch.2005,Vol.33,No.20:e179.
]。
表3-1miRNAstem-loopqRTPCR定量引物
Table3-1Primersusedinstem-loopqR-PCR
NamesPrimerSequenceTmLengthGC（%）cam_miR159RTprimer5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG
GTATTCGCACTGGATACGACTAGAGC-3'Forwardprimer5’-GCGCGTTTGGATTGAAGGGA-3'60.52055cam_miR160RTprimer5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG
GTATTCGCACTGGATACGACTGGCA-3'Forwardprimer5’-GCTGCCTGGCTCCCTGT-3'59.81771cam_miR164RTprimer5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG
GTATTCGCACTGGATACGACTGCACG-3'Forwardprimer5’-GTCGTGGAGAAGCAGGGCA-3'61.61963cam_miR166RTprimer5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG
GTATTCGCACTGG