对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱.doc

反相高效液相色谱法测定对羟基苯甲酸酯类混合物中各物质的含量

对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱
一目的要求：
1学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量；
2熟悉高效液相色谱仪的结构；
3熟悉高效液相色谱分析操作（流动相的设置、检测波长的设置、运行时间设置、保留时间和峰面积的获取）。
二基本原理
在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，它们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。
由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类各组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。这种利用纯物质对照进行定性的方法，适用于来源已知，且组分简单的混合物。
本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计算公式，与气相色谱分析相同：

对羟基苯甲酸酯类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相近的校正因子，故上式可简化为：

三实验主要仪器和试剂
LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津）配紫外检测器，色谱柱：日本岛津公司（Shim-packVP-ODS，150mm×4.6mm，5m）
试剂：1．对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、甲醇等均为分析纯；二次蒸馏水
标准溶液的配制：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯用甲醇作溶剂分别配制成1000g/mL标准贮备液；用甲醇稀释成10g/ml标准工作液；标准混合工作液分别含四种酯类化合物10g/mL的甲醇溶液。（浓度仅供参考，记录实验中具体使用的浓度）
四实验条件（3、4、5仅供参考，记录实验中具体的操作条件）
1．色谱柱：日本岛津公司（Shim-packVP-ODS，150×4.6mm，5m），
2．检测器：紫外光度检测器，检测波长254nm
3．流动相：甲醇：水(Ｖ１：V2)，流量1mL/min（以在混合试样中能分开）
4．进样量：5L
5．柱温：30℃
五、实验步骤
1．在淋洗瓶中装入足够量的甲醇和水，分别脱气5min；
2．根据实验条件，设定各操作条件的参数，然后开始走基线，待仪器液路和电路系统达到平衡
时，记录仪基线呈平直，即可进样。
3．依次分别吸取5L的四种标准工作液及标准混合工作液和未知试液进样，记录各色谱图，并各重复1次。在每次进样后，于进样信号附近标明进样溶液名称。
六数据记录及处理
1．记录实验条件
(1)色谱柱：日本岛津公司（Shim-packVP-ODS，150×4.6mm，5μm），
(2)流动相：
(3)检测器：
(4)进样量：
(5)柱温：
2．测量四种对羟基苯甲酸酯化合物色谱图的保留时间tR，并填于下表1。
表1四种对羟基苯甲酸酯化合物的保留时间
保留时间
组分tR（min）12平均值对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯对羟基苯甲酸丁酯3．依次测量标准混合液色谱图上各色谱峰的保留时间tR（min）值，并填入表2，然后与上表中h值对照，确定各色谱峰代表何种化合物。
表2未知试样色谱图
保留时间
组分定性分析定量分析tR（min）相应化合物名称峰面积相应化合物%1212峰1峰2峰3峰4七思考题
1．归一化法定量的使用条件？本实验为什么可以采用归一化法定量？
2．在高效液相色谱中，为什么可利用保留值定性？这种定性方法你认为可靠吗?
3．本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。
4.本实验中怎样调整流动相的比例改变保留时间，举例说明