尿素柱层析法分离共轭亚油酸异构体的研究.doc

尿素柱层析法分离共轭亚油酸异构体的研究
摘要
研究了负载型尿素层析柱分离共轭亚油酸甲酯异构体过程中的影响因素，考察了甲醇残留量，尿素与硅胶的比例，不同温度下结晶的固定相，不同过柱温度，不同流动相及负载溶剂对分离效果的影响，得到最佳条件下分离效果为10反12顺共轭亚油酸含量从原料的40%提高到59%。
关键词尿素柱层析共轭亚油酸甲酯异构体
前言
尿素柱层析法是利用被分离链状分子在尿素负载固定相和流动相之间的分配平衡常数的差异，经过多次分配平衡实现分离目的的，侯相林等[1]利用尿素柱层析分离制得含量为83%以上的α-亚麻酸乙酯，证明尿素柱层析法对不同双键数的链状分子具有较好的分离效果，而发明专利（￥￥￥）报道尿素柱层析法可以很好的分离顺式油酸和反式油酸，说明在尿素柱层析分离过程中，反式油酸较顺式油酸更容易保留在固定相中，反式油酸和尿素的结合稳定性更接近饱和脂肪酸。而文献####研究了神经酸和芥酸在尿素柱层析中的分离行为，证明脂肪酸饱和尾链的长短是决定与尿素结合稳定重要因素，而KlareSMarkley等发现不饱和脂肪酸与尿素的结合稳定性常数和脂肪酸分子截面影响较大，脂肪酸分子横截面越大包藏越困难，而不饱和双键越多分子截面越大。
共轭亚油酸是亚油酸共轭化的产物，亚油酸两个顺式双键中的一个在共轭化过程中会发生位移，同时顺式双键转化为反式双键。共轭亚油酸主要是（顺9，反l1）二烯酸和（l0反，12顺）二烯酸的混合物。这两种异构体所具有的生理功能有很大差异，为了更好的发挥其各自的优异功能，有必要将两种异构体进行分离。
目前大都是将亚油酸从其他脂肪酸中纯化的方法，没有针对共轭亚油酸异构体分离的直接方法，已经做的比较好的方法有尿素包合法，该法虽然成本较低，但存在收率低，污染严重等问题；
无溶剂尿素包合+超临界CO2萃取技术+冷冻分离方法分离两种异构体，工艺复杂，成本高，产业化困难
也有利用假丝酵母脂肪酶两步选择性酯化和分子蒸馏相结合，该方法虽然分离效果很好，但是成本高，收率低，难于产业化。
尿素柱层析的优点：常压低温下实现各种脂肪酸的分离，能够比较完整的保留各脂肪酸的功效与生理功能。工艺简单、产品纯度高、操作成本低、甲醇和尿素用量少、易于回收、绿色环保、易于产业化。
1实验材料与方法
1.1主要材料与试剂
无水甲醇、石油醚、尿素、无水硫酸镁、浓硫酸均为分析纯；柱层析硅胶、共轭亚油酸样品（油酸13.1%、c9，tl1～CLA32%、c12，tl0～CLA40.3%、其他CLA14.6%）。
1.2设备与仪器
层析柱（2×60）cm；自动控温水浴装置；磁力搅拌器；真空干燥箱；减压蒸馏装置；电子天平：上海恒平；HXSPGC-950气相色谱仪。
1.3实验方法
1.3.1共轭亚油酸的甲酯化处理
在100ml无水甲醇中加入3ml浓硫酸，将20g共轭亚油酸样品加入其中，50℃水浴回流5h，减压蒸馏脱除甲醇后，用石油醚和水（1：1，V/V）萃取分液，有机相用蒸馏水洗至中性，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏脱除石油醚，得到共轭亚油酸甲酯。
1.3.2柱层析固定相的制备
称取一定量尿素和甲醇并在60℃下完全溶解，加入一定量的柱层析用硅胶，在此温度下搅拌10min，冷却至室温后，将下层硅胶翻动与上层尿素晶体混合，放入冰箱上层。取出后抽滤去除甲醇，并置于真空烘箱中烘干。
1.3.3固定相中溶剂残留量的检测
精确移取2mL蒸馏水于八个试管中（容量瓶），分别加入3μL、5μL、10μL、25μL、50μL、75μL、100μL、125μL无水甲醇，在柱温100℃，汽化室和检测室150℃的色谱条件下（检测器），进样量3μL、，得到甲醇体积与峰面积的线性关系曲线：y=0.9532x，线性度R2=0.9972。
准确称取0.5g固定相，加入2Ml蒸馏水，充分摇动，过滤，滤液景象气相色谱分析，进样量3μL。以经过换算得到的线性曲线w%=0.1906A作为溶剂残留量大小的比较依据。
其中：w为固定相中甲醇的质量分数，A为色谱图中甲醇峰面积。
1.3.4装柱
称取60g柱层析固定相放入石油醚中浸泡、搅动除去其中的气泡；带气泡驱除完全，湿法装入层析玻璃管柱中，制备成负载型尿素层析柱。
1.3.5尿素柱层析分离共轭亚油酸甲酯
取一定量的共轭亚油酸甲酯，加入到层析柱上层，以石油醚为洗脱剂洗脱，每10mL收集一个洗脱份，对洗脱份进行色谱分析，确定共轭亚油酸各异构体含量。
1.3.6共轭亚油酸异构体的检测
初温200℃，汽化室和检测室温度为230℃，TL9900色谱工作站，氢火焰检测器，峰面积归一化法计算共轭亚油酸甲酯的相对含量。
检测方法？？？？？？
2结果与讨论
2.1共轭亚油酸甲酯原料的组成

甲酯化后的共轭亚油酸样品进行气相色谱分析，得到共轭亚油酸样品组成如图1，A1为油酸15.4