激光扫描共焦显微镜技术.ppt

激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术及应用激光扫描共焦显微镜技术二、原理

原理小结:
Confocal利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术的应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用3.GFP绿色荧光蛋白
GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白GFP,后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光。
将外源基因与GFPDNA相连,GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达.激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用
荧光探针 激发波长 发射波长Kd
FLuo3-AM,K+,dextran506nm 525nm390nM
Fluo4 506nm 525nm
CalciumGreen-1507nm 530nm190nM
CalciumGreen-2 507nm 535nm550nM
Furared 420/480nm 637nm140nM
OregonGreen488 494nm 520nm 20,000nM
CalciumCrimson 583nm602nm328nM
Indo-1 356nm405/458nm230nM
Fura-2 340/380476nm145nM

程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间序列的扫描测 量。
F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)
Ca2+浓度绝对测量
1）单波长公式法
Fluo3:530nmKd=450nM

[Ca2+]I=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)

Fmin:细胞内无钙时的荧光强度(MnCl2)
Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187)

测量时切记细胞内静息Ca2+浓度的相对荧光强度值不能太低（F值不低于40）

细胞内生理Ca2+浓度值（10-8-10-7M）
细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）
2）标准曲线法
根据仪器条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Buffer(EGTA-Ca2+)做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度
3）比例荧光的测量

.双波长(比例荧光：ratio)
Indo1(360,420/480),fura2(340/380,440)

[Ca2+]I=Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2

激光扫描共焦显微镜应用细胞器的Ca2+测量
1.线粒体内游离Ca2+测量
Fluo-3+TMRM(线粒体荧光探针，红色）

2.特异定位的重组水母发光蛋白
水母发光蛋白与Ca2+结合后发蓝光
用含有水母发光蛋白和含有特定细胞器蛋白的表达载体转染细胞，可测定亚细胞器内的游离Ca2+变化
目前已商品化的探针可检测：线粒体、内质网、细胞核内的游离Ca2+，因生物发光很弱不能使用Confocal检测细胞内游离Ca2+测量的应用
钙的特性
1．细胞内外的电化学梯度103-104倍
2．细胞膜渗透性稍有改变或钙库释放稍有增加，导致
胞内钙明显升高
3．细胞内钙为细胞激活“开关”
细胞内钙的生理作用
1．肌肉的兴奋收缩-收缩偶联
2．神经递质的释放
3．学习记忆的增强
4．卵子受精
5．细胞分裂和再生
6．细胞调亡
7．细胞间通讯

8．细胞信号传导
9.DNA合成
10.基因表达