胡萝卜愈伤组织的培养.doc

胡萝卜愈伤组织的培养
摘要：实验中的胡萝卜的组织培养实验成功率比较低，主要体现在污染率较高和出芽率低上，在长期的实验中，有些胡萝卜的愈伤组织基本分化不出芽。针对这一问题我们反复实验。通过把培养出来的胡萝卜的愈伤组织进行悬浮培养后，再转接到固体培养基上，从而使得胡萝卜愈伤组织更容易分化出芽来。并使整个过程控制在无菌条件下，现就胡萝卜组织培养的整个实验过程控制作一详细介绍。
关键词：胡萝卜；组织培养；无菌控制
实验流程
（1）实验总流程：
MS母液培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配制→胡萝卜愈伤组织诱导→胡萝卜愈伤组织的继代培养→观察记录
（2）无菌操作流程：
实验员消毒→实验室、无菌台灭菌→实验器材的灭菌→无菌接种→消毒→实验台卫生
（3）胡萝卜愈伤组织诱导培养流程：
胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的分装→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基灭菌→取材及材料的消毒灭菌→接种与培养
（4）胡萝卜愈伤组织的继代培养流程：
器械及实验者的消毒灭菌→剥离愈伤组织诱导培养所得的愈伤组织→胡萝卜愈伤组织接种
实验仪器及材料
胡萝卜(市场购买)、超净工作台、光照培养架、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡器、打孔器、小刀、培养皿、解剖刀、镊子、植物组培试剂盒。
实验方法与步骤
3.1胡萝卜愈伤组织的诱导
①外植体消毒用清水洗干净胡萝卜直根，用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧杯中。先用70%酒精对胡萝卜直根消毒5min，用无菌吸水纸吸干，再用10%的次氯酸钠溶液消毒10min（或用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍，再用无菌水浸泡30min），放入无菌水中漂洗2~3次，用无菌吸水纸吸干待用。
②外植体接种。把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度1mm左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，再将形成层切成大约长5mm、宽5mm、高1mm的小长块(如图1a)。为了操作简便、快速，外植体美观，建议使用打孔器切取胡萝卜外植体。具体操作方法:把消毒好的胡萝卜直根放于无菌培养皿中(建议使用一次性塑料培养皿)，用小刀将其切成2~3cm的小段，用灭过菌的打孔器沿着形成层穿入胡萝卜中，取得一段含有形成层的2~3cm的圆柱体，然后用无菌解剖刀片将其切成厚1mm的小薄片，将切好的胡萝卜外植体接种在MS+2mg/L2,4-D+1.5mg/LKT的固体培养基上，放于黑暗处25℃条件下进行暗培养，50d后长出淡黄色愈伤。
3.2胡萝卜愈伤组织悬浮体系的建立
用镊子夹取在固体培养基上继代20d的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤用解剖刀切碎，接种在MS+0.3mg/L2，4-D+3%蔗糖的液体培养基(pH5.8)中，每100mL的三角瓶中加入MS液体培养基50mL，摇床转速为110r/min，温度为25℃，黑暗培养，每隔7d继代一次，连续培养4代~5代后逐渐形成稳定的细胞系。
3.3悬浮细胞系的继代
采用吸取法、静止法和瓶壁法进行继代培养。吸取法是用吸管吸取一定体积的悬浮培养物转入至新鲜培养基的一种方法。静止法是将培养物摇匀，静止片刻，待大块的愈伤组织和细胞团下沉后，将上清部分转至空的灭菌三角瓶，再静止直至细胞团基本沉入瓶底，小心弃去1/2体积的上清，然后添加新鲜培养基进行继代培养的一种方法。瓶壁法是利用悬浮培养物在振荡培养的过程中会产生附壁现象，即在三角瓶的周围形成一个细胞圈，然后将这一部分细胞用勺子刮下转入新鲜培养基中进行继代培养的一种方法。
3.4胡萝卜愈伤分化
将胡萝卜悬浮细胞和愈伤组织分别转入含不同激素及其组合的分化培养基中，25℃，光照培养。分化培养基分别为:①B5(MS)基本培养基(不添加激素)；②B5(MS)基本培养基+1.0mg/LBA；③B5(MS)基本培养基+1.0mg/LBA+0.5mg/LNAA。
3.5再生苗的生根及移栽
将没有生根的再生苗转移至MS+0.2mg/LNAA生根培养基中生根壮苗。待根系发达移栽至蛭石：草炭土=3:1的基质中培养。
结果
(1)以胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层均可诱导出愈伤组织，其中以下胚轴诱导出的胚性愈伤组织最适合细胞悬浮培养。
(2)诱导松散型愈伤组织最佳激素浓度配比为以MS或B5基本培养基加2，4-D0.1mg/L较好，最适温度为21℃~25℃，pH值为5.8。
(3)在4次~5次继代时，细胞系趋于稳定。
(4)细胞起始密度在1.125*104个/50mL~2.325*104个/50mL时，7d~9d为对数生长期。
(5)悬浮细胞转入MS固体培养基，7天长出新的愈伤组织，30天长出全株，并移植蛭石成活，目前已经长出胡萝卜。
5.分析及讨论
5.1悬浮细胞系
一个成功的悬浮细胞系一般来说具备以下3个特征:一是悬