茚三酮比色法测定赖氨酸含量.doc

茚三酮比色法测定赖氨酸含量
一.目的了解赖氨酸总含量的测定方法。掌握用比色法测定谷物类样品中赖氨酸含量。二.原理蛋白质中的赖氨酸残基上具有一个游离的e-NH2，它与茚三酮起颜色反应呈蓝紫色，在波长570nm处其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸残基的含量成线性关系。亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，它仅有的一个氨基（a-NH2）相当于蛋白质中赖氨酸残基上的e-NH2，因而可以用亮氨酸标准液制作标准曲线来测定蛋白质中赖氨酸的含量。但计算浓度时必须乘上两种氨基酸的分子量之比（赖氨酸与亮氨酸分子量之比为1.11:1）。
式中W：样品质量C：样品中游离氨基酸的量，各种作物种子中游离氨基酸的含量大约是：玉米：0.01%，高粱：0.04%，水稻：0.01%，小麦：0.05%X：从标准曲线查得的赖氨酸的质量
三.实验材料及设备1.材料玉米粉
2.仪器分光光度计分析天平恒温水浴
3.器材刻度试管：25mL×11移液管：1mL×12mL×220mL×1烧杯：250mL×250mL×1滴管：2洗耳球：2滤纸：f11cm研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1
四.试剂的配制1.柠檬酸缓冲液（0.2mol/L，pH5.6）(参见附录二)2.茚三酮试剂称3g茚三酮溶于100mL95%乙醇中，溶解后加入160mg二氯化锡，搅拌溶解后加入100mL柠檬酸缓冲液中，搅匀备用。
3.亮氨酸标准液（50mg/mL）准确称取5mg亮氨酸，用蒸馏水稀释定容到100mL，则得浓度为50mg/mL的标准液。
五.操作步骤1.样品液的制备(1)取材：称取烘干、粉碎（过80目筛）的玉米粉0.3g（油料种子须经脱脂处理）。(2)提取：将称取的样品放入试管，准确加入20mL蒸馏水，摇匀。读取样品悬液的总体积mL，置于80℃恒温水浴中提取20min。（可间歇摇动）(3)定容：冷却后，用蒸馏水将试管中悬液定容至（2）中悬液总体积刻度mL,，即最终样品液总定容体积仍为20mL，摇匀。(4)过滤：将提取液用滤纸过滤，收集滤液作为待测样(滤纸不能用蒸馏水湿润)。2.标准曲线制作及样品测定取9支刻度试管，按下表所示顺序操作。

六.结果处理1.由0～6号管的数据，以亮氨酸含量(mg)为横坐标，A570为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；2.求样品管A570的平均值570；3.由530从标准曲线中求样品管中赖氨酸的含量(mg)；4.计算你所取生物材料中赖氨酸的含量（单位用mg/mg样重）。