超薄切片法.doc

超薄切片法
（一）以Epon812为包埋介质的植物组织制样流程
1取材：常温取样，低温保存（0~4℃）。
2固定和浸洗：1%~3%戊二醛固定液固定2h，最多不超过1周。PBS缓冲液20~30min(更换1~3次)，然后1%~2%OsO4固定液固定1~2h，PBS缓冲液20~30min(更换1~3次)。
3脱水：30%丙酮水溶液，50%丙酮水溶液，70%丙酮水溶液（或冰箱过夜）10~20min，在常温条件下，90%丙酮水溶液，100%丙酮水溶液，“纯丙酮”（更换2次）每次10~20min。
4渗透：Epon812混合液：纯丙酮（1:3）12h，Epon812混合液：纯丙酮（1:1）12h，Epon812混合液：纯丙酮（3:1）12h，Epon812混合液（35~40℃）12h。
5包埋和聚合：将组织放入胶囊（或包埋板）中，加入新鲜的Epon812混合液，放烘箱中加热35℃12h，45℃12h，60℃24h，树脂聚合后，待冷却到室温，进行切片。
6制刀：用制刀机制出刀刃锋利的玻璃刀。若用钻石刀则省略此步。
7修块：经粗修，将包埋块修整合适。
8切片：在切片机上固定好包埋块和切片刀，调整刀位后对刀、进刀，完成细修后切片，厚度60~80μm，铜网捞片，风干或灯下烤干。
9染色：常规铅-铀染色。（把一张滤纸平铺在有盖平皿底部。用配制染剂的溶液将其润湿，上放一小片干净牙科蜡。将染液滴于蜡块上，迅速盖上平皿盖。将欲染载网浮在液滴上，注意切片朝下。一般采用铀-铅双染法：先用1～3％醋酸双氧铀水溶液或70％酒精溶液将载网按上述方法染20～30min。染后必须清洗，一般用钟表镊子夹载网浸入清洗液中，反复清洗，清洗液可放在试管中或小瓶中。经三瓶清洗液即可。注意将镊子中间夹缝液体用一小片滤纸将其吸干。用硝酸铅与柠檬酸钠配制成柠檬酸铅，将其溶于氢氧化钠，可得到稳定的强碱溶液（pH12）。染、洗方法同前。用铅染时，可用0.1MNaOH浸湿滤纸，以吸收空气中CO2，防止生成碳酸铅沉淀污染切片。或将NaOH放在牙科蜡周围。配制染液用的蒸馏水应煮沸10min以驱除CO2，染毕，用0.02NNaOH(准确称取取0.8g的氢氧化钠，溶于500ml蒸馏水中，再移入到1000ml容量瓶中，定容至刻度。)和无CO2蒸馏水连续冲洗以除去载网上多余染液，载网清洗后置于培养皿的滤纸上干燥。）
10镜检：将染色后的切片放入干燥器中干燥后，在透射电镜下观察实验结果。
（二）整体样品表面结构观察的制样方法
1取材：取样要准确，体积不宜过大，以减少不必要的观察量。取样时动作要轻巧，防止挤压损伤样品。
2固定：一般采用双固定法，即先用1%~3%的戊二醛/缓冲液在室温或4℃下固定。一般单细胞可固定10~30min，较大的样品固定1~2h，甚至更长，再用1%OsO4/缓冲液在4℃下固定30~60min。
3清洗：对于表面凹凸不平，且粘有很多杂质的样品，在固定前后都要进行彻底的清洗，以免影响成像的质量。一般采用缓冲液冲洗法：缓冲液在4℃下彻底冲洗3次，每次15min。
4脱水和置换：用系类乙醇或丙酮逐级脱水。一般30%，50%，70%，80%，90%，100%，每步15~20min。用乙酸异戊酯置换100%的乙醇，在室温下，置换20min以上。
5干燥：CO2临界点干燥(1置换：把已经固定好，并脱水到100%乙醇的样品浸入乙酸异戊酯中20min以上，室温或4℃。2仪器准备：打开总电源，先向HCP-2中注入少量液体CO2，再用放气阀排出，以检排放是否通畅。同时对样品室预降温，以低于室温10℃为宜。3准备样品：把样品笼的底和盖都垫好干净的滤纸，并滴上乙酸异戊酯，将样品面朝上放入，扣牢样品笼盖。将样品笼放入样品室，用旋转棒旋紧样品室盖。4注入液体CO2：打开进气阀，控制流量，使液体CO2缓缓进入样品室。通过观察窗判断液面，以液面充盈样品，略高出样品笼高度为宜。压力表指示60~70kg/cm2。注入完毕时，将进气阀关闭。5调温：调节控温钮至20℃，保持15~20min，使液体CO2充分置换乙酸异戊酯。然后再调节至35~40℃，使压力维持在73kg/cm2以上，不要超过110kg/cm2，稳定后维持5~10min。6排气：在维持原温度的条件下，轻轻打开慢排气控制钮，控制排气量，以计量管中的小球悬浮在中间微微地上下跳动为宜，或使排气管在水中吐出的气泡既连续不断又可数清为宜。7取出样品：气压降至零后，将温度调至略高于当时室温，打开盖，取出样品，迅速放入玻璃干燥器中。)。
6粘样：将干燥好的样品用导电胶或双面透明胶纸粘在样品台上，做好标记。
7喷涂：喷涂要在真空条件下进行，有专门的仪器，一般喷涂10~20μm厚的金或铝，使样品有良好的导电性，能顺利释放二次电子。

离子溅射镀膜法:1样品准备：将样品充分干燥