DNA的粗提取与鉴定 Microsoft Word 文档.doc

课题1DNA的粗提取与鉴定
一、课题目标
本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。
二、课题重点与难点
课题重点：DNA的粗提取和鉴定方法。
课题难点：DNA的粗提取和鉴定方法。
三、课题背景分析
生物体的性状之所以能够遗传给后代，是由于生物体内具有DNA或RNA这些遗传物质。通过必修2《遗传与进化》的学习，学生已经学习了证明DNA是主要的遗传物质的实验证据。那么DNA究竟是什么样的呢？本课题通过实验操作，使学生对DNA有一定的感性认识。
四、基础知识分析与教学建议
知识要点：1.DNA的物理化学性质，尤其是DNA的溶解性；2.二苯胺法鉴定DNA的方法和原理。
教学建议
1．在教学过程中，教师要引导学生分析插图5-1“DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线”，使学生理解：在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。利用上述原理，可以将DNA溶于高浓度的NaCl溶液中，使其与其他物质分开。
2．教师要注意引导学生认识DNA和蛋白质对酶、高温和洗涤剂的耐受性的不同。教材在实验设计中关于去除滤液中杂质的第二、第三个方案，正是利用了上述不同的特性，从而达到分离DNA和蛋白质的目的。
3．教材中介绍了用二苯胺法鉴定DNA的方法，教师可以引导学生结合教材中的资料，利用所学的知识，采用其他的方法鉴定DNA，如电泳法、紫外灯照射法等。
五、实验案例
案例一以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取
课前准备
本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。
教师可以到市场售活鸡处索取鸡血，所带烧杯中必须提前放入抗凝剂柠檬酸钠溶液。具体制备方法如下。取质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500mL烧杯中，注入新鲜的鸡血（约180mL），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免血液凝结。将烧杯中的血液置于冰箱内，静置1d，使血细胞自行沉淀。有条件的学校也可以将血液倒入离心管内进行离心，用2000r/min或3000r/min的转速，离心2min，使血细胞沉淀于离心管底部，这样可以使血细胞沉淀更完全。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。值得注意的是鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。
提取DNA的具体步骤
1.破碎细胞，释放DNA
鸡血细胞中的DNA与核蛋白结合，位于鸡血细胞的细胞核中，正常情况下是不会释放出来的。为了使DNA从细胞核中释放出来，需要向鸡血细胞液中加入蒸馏水，并且搅拌，从而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。一般5～10mL的鸡血细胞液加入20mL蒸馏水搅拌5min。释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用3～4层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。
2．溶解细胞核内的DNA
在浓度较高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游离出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度为2mol/L的NaCl溶液，搅拌1min。注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。
3．DNA的析出
将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。教材中列举了提取DNA的三种方案，本案例选取方案一。加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的终浓度为0.1～0.2mol/L。加水过程一般分三次进行，当总加水量为300mL左右时，DNA已基本析出。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。
用3～4层纱布对DNA稀释液进行过滤，滤去蛋白质，收集DNA的黏稠物。如果采用离心法，效果更好。用4000r/min转速的离心机，离心15min，除去上清液(含有蛋白质)，留下的沉淀物中含有DNA。此时注意观察DNA黏稠物的颜色。
4.DNA的初步纯化
如果提取的DNA量不够多且其中含有较多杂质，或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范，都会导致实验现象不明显，常常使制取的DNA粗制品不能显示出DNA的本色──白色。为了增进实验效果，需要对DNA粗制品进行简单的提纯，下面的方案可供参考。
将DNA黏稠物再溶解，继续用2mol/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠