克氏原螯虾两种模式识别受体基因的克隆、重组表达及功.pdf

中国海洋大学

博士学位论文

克氏原螯虾两种模式识别受体基因的克隆、重组表达及功能分
析

姓名：董超华

申请学位级别：博士

专业：生物化学与分子生物学

指导教师：杨官品;宋林生

20090601
克氏原螯虾两种模式识别受体基因的克隆、重组表达及功能分析要捅模式识别受体(Patternreceptor,PRR)是由胚系基因编码的一类参与病原识别的蛋白质，它们能够与微生物表面病原相关的分子模式(Pathogenpattern,PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫系统。本研究首先在甲壳动物中建立了RNA干扰技术，并利用新建立RNA干扰技术结合基因原核重组、荧光定量PCR等分子生物学技术对克氏原螯虾(Procambarusclarkii)的两个模式识别受体基因脂多糖和f3-1，3一葡聚糖结合蛋白基因以及C一型凝集素基因进行了研究。首先，通过体外转录合成目标基因的双链RNA，将双链RNA注射克氏原螯虾或凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)个体，建立了稳定RNA干扰技术，能够有效沉默目标基因的表达。而且，这种RNA干扰介导的基因沉默效应能够系统性的发生，至少持续96小时，能够满足本研究中对模式识别受体基因功能鉴定的要求。Ends)技术从克氏原螯虾clarkiOdfl克隆、鉴定了两个模式识别受体基因：脂多糖和p．1，3．葡聚糖结合蛋白基因(命名为PcLGBP^)和C一型凝集素基因(命名为P吐EC)。PcLGBP基因eDNA全序列包含一个1107bp的开放阅读框(Open编码369个氨基酸。在N末端有一个17个氨基酸的信号肽，表明PcLGBP是一个分泌的胞外蛋白。PcLGBP蛋白的氨基酸序列中包含一个糖基水解酶结构域和一个p一1，3．糖苷键识别序列(Phe235．Asp253)以及两个细胞粘附位点(RGD106．108，157．159)和一个N糖基66．69)。在其类葡聚糖酶结构域还包含决定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析发现PcLGBP与甲壳类动物的脂多糖和B．1，3葡聚糖结合蛋白protein,BGBP)同源，与一些昆虫的革兰氏阴性细菌结合蛋白protein，GNBP)及葡聚糖酶的一致性高于40％。为分析PcLGBP基因的功能，通过半定量RT-PCR方法研究了其在组织中的分布，并用荧光定量PCR技术分析了其对细菌刺激的响应，结果表明PcLGBP基因是肝胰腺特异表达的基因，能响应热致死鳗弧菌刺激而增强表达，说明PcLGBP基因可能参与螯虾的细菌防御反应。利用酶联免疫法对重组PcLGBP蛋白与细菌和真菌表面多糖的结合活性进行了鉴定，表明重组随后，利用RACE(RapidAmplification(Procambarusframe，ORF)，化位点(NRSILGBP(Lipopolysaccharidep—l，3一glucanprotein,LGBP)或p一1，3葡聚糖结合蛋白(B．1，3一glucan(Gram-negativeeDNAbinding克氏原螯虾两种模式识别受体基因的克隆、重组表达与功能分析recognitionassociatedmolecularofreadingandbacteria
典的短型凝集素。利用实时定量PCR技术泖吐EC基因的组织表达和细菌刺激后的时序表达量相对较低。同时，热致死的细菌注射能显著增酗cLEC基因的表达。对重组PcLEC防御中的作用，利用RNA干扰技术沉默尸吐∞P基因的表达，并用三种不同的病原菌进PcLGBP蛋白能与来源于革兰氏阴性细菌的脂多糖和来源于真菌的13．1。3．葡聚糖结合，而对来源于革兰氏阳性细菌的肽聚糖则没有结合活性。为进一步了解PeLGBP基因在细菌行了细菌侵染实验。PcLGBP基因沉默显著降低了克氏原螯虾对革兰氏阴性细菌的防御能力，而对革兰氏阳性细菌侵染没有显著的影响。PcLEC基因的eDNA全序列包含一个813bp的ORF，编码271个氨基酸，在N末端有一个17个氨基酸的信号肽，以及一段富含甘基酸的序列，在C末端有一个糖识别结构域domain，CRD)。另外还有四个半胱氨酸残基，可能参与形成两对链内二硫键。PeLEC同甲壳动物、昆虫等物种的C型凝集素都有明显的序列相似性。空间结构预测表明，PeLEC与经典的半乳糖结合C．型凝集素具有相似的空间结构，有七个13折叠，2+a螺旋共九个二级结构元件，有两对二硫键和一个长环状结构，是一个经表达变化进行了检测。在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞等六个组织中均检测到PcLEC基因的表达，其中在血细胞和肝胰腺中的表达量最高，而在肌肉、鳃和性腺中的蛋白进行凝菌实验表明重组PcLEC对大肠杆菌、鳗弧菌和藤黄微球菌都表现出依赖Ca2+的凝集效应，这种凝集效应能够被半乳糖和N．乙酰半乳糖胺抑制。酶联免疫实验进一步