(讲座)miRNA在肿瘤研究中的应用.pdf

GeneCopoeiaTM
www.genecopoeia.com
4006020200
唐珍洁
提纲

•miRNA简介

•miRNA在肿瘤研究中的应用

•miRNA研究的完整解决方案

•GeneCopoeiaTM提供的产品和服务
miRNA的形成和作用机制
与肿瘤特异相关的miRNA
miRNA在肿瘤研究的应用

•作为治疗的工具
1.miRNA的再表达
2.Anti-miRNA的应用
3.靶保护者

•作为诊断和判断预后的工具
miRNA的完整解决方案
miRNA研究方法的案例
寻找感兴趣的miRNA

检测方法：
检测对象：
‡Nothernblot
•Primary-miRNA

‡Microarray•Pre-miRNA

•MaturemiRNA
‡QuantitativeReal-time
PCR

‡全测序，如MPSS
QuantitativeReal-timePCRdetectmiRNA

Loop反转录法PolyA加尾法
miRNAQ-PCRArray
All-in-OneTMmiRNAqPCRArray案例

35
30
25
20
15
10
5
0
0100200300400500600700
-50
XData
-100
-FoldChange+
-150

-200

-1200
-1400
0100200300400500600700
719miRNAs

DifferentialexpressionofmiRNAsinCRC
miRNAqPCR验证引物数据库

•人、小鼠、大鼠miRNA的Q-PCR引物都通过严格的实验验证
•http://www.fulengen.com/product/search/index.php?prt=22
•输入miRNAname、AccNo或Sequence等即可获得验证结果
几种主要的miRNA检测方法的特点和灵敏度比较

miRNA检测技术特点检测灵敏度

操作复杂，耗时长，样本需求量低灵敏度
NorthernBlot大

高通量，假阳性高，重复性差较高灵敏度
Microarray

可高通量，高精度定量，样品消高灵敏度
qRT-PCR耗少，相对成本低

高通量，结果准确度高，但成本高灵敏度
MPSS高
miRNome筛选结果
获取感兴趣的miRNA
miRNAfunctionanalysis

•功能获得研究：把miRNA导入到细胞，进行研究
–miRNAmimics
–miRNAexpressionclones

•功能缺失研究：抑制miRNA的表达
–miRNA抑制剂
–miRNA抑制剂表达克隆
miRNAmimics

修饰方式修饰类型作用

硫代磷酸（PS）磷酸骨架修饰提高了抗核酸酶的能力，增加稳定性

甲基化（2'-OMe）
使s具有更强的抵抗核酸酶水解的性能，增加
核糖修饰
稳定性
氟代（2'-FU,FC）

胆固醇（cholesterol）末端连接增强细胞的吸收；延长在血清中的半衰期

增强细胞的吸收；延长siRNA在血清中的半衰
聚乙二醇（PEG）末端连接
期

短肽（peptide）末端连接增强细胞的导向和吸收等

生物素（Biotin）末端连接生物素标记用于机理和生物学等研究
Vector-BasedmicroRNAExpressionclones
Mimics与miRNA表达克隆的比较
miRNA功能缺失机制

miRNA抑制剂，基于miRNA的反义核酸原理

miR-199a/b-3p的功能研究

体外试验
miR-199a/b-3p可抑制HCC的生长
miRNABioinfoanalysis

内容：

1：miRNA序列及同源性分析

2：miRNA靶标的计算机分析

相关数据库：

•miRBase：microrna.sanger.ac.uk

•PICTAR:pictar.bio.nyu.edu

•TARGERSCAN:www.targetscan.org
miRNAtargetvalidation

•miRNA的靶标确证

•miRNA靶标的高通量筛选
用于miRNA靶标确证的克隆

萤火虫荧光素酶作为报告基团，海肾荧光素酶用于监测转染，表达效率，并可以作内参
miRNA靶标确证

pEZX-MT01

microRNA

Translation

hLuc

LightNoLight
miRNA靶标的高通量筛选

利用miRNA表达克隆和抑制克隆，结合免疫共沉淀进行高通量
miRNA靶标确证

miRNA诱导形成的基因沉默复合体，包含：miRNA、mRNA、Ago等蛋白
miRNAexpressionmiRNA