质粒DNA的转化.pdf

一．实验名称：质粒DNA的转化

二．实验目的：将编码目的蛋白的质粒导入大肠杆菌体内，从而大量

扩增并表达目的蛋白

三．实验原理：转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得

新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰

系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（R-，M-）。

将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透

性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体

细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，

即可筛选出转化子（带有异源DNA分子的细胞）

四．实验步骤;

1.把固态培养基加热融化，由于温度较热用自来水冲洗瓶身降温（十

度左右会再凝固，所以不能冲洗太久），在超净台中加入千分子一的

AP（本质粒具有抗AP性，故AP能抑制别的细菌生长），然后向

平皿中倒入少许（大约5毫升）培养基，表明自己名字

2.到-80℃冰箱取出质粒（每瓶100微升，可制作两板）迅速放入冰

盘保存，放入4℃保存30min

3.将上述混合物放在42℃水浴锅中融化90s（据经验42度90s最适

合），在超净台中用针尖沾取少许质粒放入大肠杆菌EP管内（质粒

为提纯多的所以加很少，一般未提纯的加1微升），再加200微升

无抗培养基，加完后放回冰盘（热：壁通透性大，冷:通透性小，起

封闭作用）放入摇床15min。

4.摇完后用微量加样枪析出滴到制作好的培养皿的中央，然后慢慢

铺满平皿底部（千万不能滑到边缘，由于量比较少，滑到边缘就不容

易再铺），表明细菌名称，实验时间，放入4℃温箱隔夜保存

5.观察有稀疏斑点状菌落，从4度冰箱取出培养基，在超净台中，取

四支带帽试管（表有黄线者为抗AP）分别倒入培养基至黄线处；用

过火的镊子夹取黄枪尖（枪尖过火要快以防烧焦）按象限沾取菌落一

枚，放入试管中，注意整个过程要过火。

6.将试管放入摇床中，未完待续

五．实验结果:

六．注意事项：1.培养基溶解后冲洗降温不要太久以免再凝固2.取

质粒尽可能的一直放入冰盒3.42度90s4.铺板要匀

【原理】

转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用

的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（R-，

M-）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性

改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复

制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养

基上培养，即可筛选出转化子（带有异源DNA分子的细胞）。

本实验采用法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，低渗溶液中，
CaCl2CaCl2

大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物

粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在

非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（

Ampr）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，

即可获得细菌菌落。

本实验是将人Bcl-2重组质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛

选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。

含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌用于质粒DNA的扩增，获得的质粒将作为限制性内切

酶的酶切底物DNA。

【试剂与器材】

1．LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭

菌消毒。

2．LB固体培养基LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手

背时铺培养皿。

3．高压灭菌消毒或过滤除菌。
0.1mol/LCaCl2

4．氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。

5．人Bcl-2重组质粒它是EcoRⅠ单酶切的pBluescriptⅡKS(-)载体与EcoRⅠ

单酶切的人Bcl-2cDNA重组而成的，大小为4861bp，前者是一种由pUC19质粒衍

生而来的具有2961bp的质粒载体。因此用EcoRⅠ酶切则应到空载pBluescriptⅡ

KS(-)载体(2.96kb)和人Bcl-2cDNA片段(1.9kb)。配制成2g/1μl。

6．大肠杆菌DH5α此为DNA扩增菌

7．恒温水浴箱

8．超净工作台

9．高速冷冻离心机

10．恒温摇床

11．恒温箱

12．消毒离心管

13．消毒tips

14．玻璃培养皿