流式样本处理方法.doc

本人累积了一堆的问题，急需请问园子里的各位高人：1、流式细胞仪分析，细胞体积是否必须控制在至少0.2-0.5ml，我的细胞样品最后用100μlbuffer重悬上机分析，体积是否太小？同时，控制1×106（也有的要求1×105~5×105）是指细胞浓度还是数量？2、一般说每个样品需要分析10000个细胞，流式细胞仪会自动采集需要的数量，那么在上机前是否需要有效的控制一定的细胞数量呢？3、样品在上流式检测前要做什么必要的处理吗？比如鞘液处理、样品过滤等，一般需要哪些药品或是溶液阿？由于本人联系的地方对流式没有专门的操作人员，这些问题都让我自己弄明白。4、流式分析是否一定要阴性和阳性对照组，如何设置，是否是阴性指不染色的对照组样本，阳性指染色的对照组样本？本人现在一个人在公司做毕业论文，没有师兄师姐可以请教，希望在此大家帮帮忙，谢谢了。1、流式细胞仪分析，细胞体积是否必须控制在至少0.2-0.5ml，我的细胞样品最后用100μlbuffer重悬上机分析，体积是否太小？同时，控制1×106（也有的要求1×105~5×105）是指细胞浓度还是数量？100ul的体积够了，10的六次方是指细胞密度，这样的细胞密度上机比较合适2、一般说每个样品需要分析10000个细胞，流式细胞仪会自动采集需要的数量，那么在上机前是否需要有效的控制一定的细胞数量呢？细胞数量不用过多，但是最好保证细胞密度，密度过低上机时间会很长3、样品在上流式检测前要做什么必要的处理吗？比如鞘液处理、样品过滤等，一般需要哪些药品或是溶液阿？由于本人联系的地方对流式没有专门的操作人员，这些问题都让我自己弄明白。上样前细胞要制备成细胞悬液，如果是悬浮细胞只要离心重悬到适合的密度就可以了，如果是贴壁生长的细胞要先消化、终止、离心、再重悬，如果是组织可以用手术剪剪碎或者匀浆器匀浆，然后用300目的滤网过滤。然后根据实验设计确定选择是否固定细胞，固定液根据实验不同选择酒精或者多聚甲醛。然后加入荧光染料或者抗体，孵育一定时间后上机检测。4、流式分析是否一定要阴性和阳性对照组，如何设置，是否是阴性指不染色的对照组样本，阳性指染色的对照组样本？阴性对照肯定是需要的，阴性对照扣除抗体非特异性结合产生的荧光，理论来说应该选用荧光标记的IgG作为阴性对照，实际操作的时候也有直接用不染色的样本来调节参数的。到图书馆借本流式的书，或者在本版查询相关的专题这些问题都能找到答案的。我做的是比较常规精液和分离精液的精子线粒体膜电位、精子质膜磷脂酰丝氨酸外翻和染色体结构变化的区别，不同染料染色后上流式细胞仪分析。您的回答对我很有帮助，十分感谢，毕业论文继续努力中。

(一)直接免疫荧光标记法

取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法

取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆">克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法

1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。

3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。

通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。

4．使用F(a