2017104797670基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利

(10)授权公告号CN107314965B
(45)授权公告日2020.07.31
(21)申请号201710479767.0(51)Int.Cl.
(22)申请日2017.06.22G01N15/14(2006.01)
G01N27/62(2006.01)
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号CN107314965A审查员周程丽

(43)申请公布日2017.11.03
(66)本国优先权数据
201710281884.62017.04.26CN
(73)专利权人马鞍山普梅森医学检验实验室有
限公司
地址243000安徽省马鞍山市郑蒲港新区
277号4号楼
(72)发明人丁显廷张婷李轶洋
(74)专利代理机构安徽知问律师事务所34134
代理人郭大美
权利要求书1页说明书7页附图1页
(54)发明名称
基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样
本前处理方法
(57)摘要
本发明公开了一种基于流式结合ICP-MS单
细胞蛋白检测的样本前处理方法，属于流式细胞
术的样品前处理技术领域。本发明包括(1)全血
样本的采集和运输，(2)PBMC细胞分离，(3)细胞
活性染色，(4)细胞刺激，(5)细胞固定，(6)表面
抗体染色，(7)胞内磷酸化蛋白染色和(8)单细胞
标记等步骤，将金属元素标签标记的抗体与细胞
表面抗原结合，将标记好的细胞与作为内参用于
标准化的beads混合，前处理过程中区分死细胞
与活细胞，以免出现死细胞数量过多影响实验结
果的分析与阐述，区分单细胞与细胞二聚体、三
聚体甚至多聚体，能很好的满足流式结合ICP-MS
单细胞蛋白检测需求。
CN107314965B
CN107314965B权利要求书1/1页

1.基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，其特征在于：包括以下步
骤：
(1)全血样本的采集和运输：采集全血样本，样本中添加抗凝剂，常温保存运输；
(2)PBMC细胞分离：采用Ficoll淋巴细胞分离液对全血样本中的细胞进行分离，具体步
骤为：用生理盐水/PBS缓冲液/Hanks液将全血样本1：1稀释后，转移至含1倍体积Ficoll淋
巴细胞分离液的离心管内，离心，吸出中层白色的PBMC细胞转移至新的离心管中，以无血清
DMEM/1640离心清洗后，再用无血清的DMEM/1640重悬细胞沉淀；
(3)细胞活性染色：采用顺铂对分离的细胞进行染色，染色时间控制在5-10min，染色结
束后离心去上清液，对细胞进行重悬；
(4)细胞刺激：将细胞转移至培养箱中培养15～30min，使细胞恢复“静息”状态，并根据
适当的刺激物及刺激方法对细胞进行分组刺激；
(5)细胞固定：对步骤(4)中重悬的细胞进行PFA固定、冻存；
(6)表面抗体染色：将PFA固定、冻存的细胞融化后，重悬，加入细胞染色缓冲液，离心去
除上清后，加入BlockingMix重悬，常温静置后加入cocktail混匀；
(7)胞内磷酸化蛋白染色：将表面抗体染色后的细胞用PBS缓冲液和甲醇处理后，用
cellstainingBuffer重悬，加入磷酸化抗体cocktail混匀，常温孵育之后用Cell
StainingBuffer清洗去上清；胞内磷酸化蛋白染色的具体步骤为：将表面抗体染色后的细
胞用PBS缓冲液混匀后放置冰上，然后加上预冷的甲醇混匀，放置冰上15min以上，离心弃上
清，用cellstainingBuffer重悬，加入等体积的磷酸化抗体cocktail混匀；
(8)单细胞标记：步骤(7)中染色后的细胞用PBS缓冲液重悬，滴入含有金属元素标记物
的cellintercalation溶液进行标记，随后分别用CellStainingBuffer和水进行清洗，
最后将细胞重悬于含有EQbeads的水中保存。
2.根据权利要求1所述的基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，其
特征在于：所述步骤(1)中全血样本常温保存的温度范围为15-35℃。
3.根据权利要求1所述的基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，其
特征在于：所述步骤(1)中的抗凝剂为肝素或者柠檬酸盐。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前
处理方法，其特征在于：步骤(4)中所述的刺激物为可以引起细胞蛋白和基因调控变化的药
物或激酶，包括但不限制于阿霉素、紫杉醇、干扰素、生长激素。
5.根据权利要求4所述的基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，其
特征在于：步骤(5)中细胞固定的具体步骤为：将步骤(3)中重悬的细胞加入等体积的2×固
定液混匀，孵育后加入0-4℃的CellStainingBuffer，然后离心