烟草淀粉酶活性与多酚氧化酶活性测定实验方案.doc

烟草中淀粉酶活性与多酚氧化酶活性的测定

淀粉酶活性的测定
原理：根据淀粉酶水解淀粉产生的一系列还原性糖类可将3，5-二硝基水杨酸还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，通过溶液颜色的深浅可反映出还原性糖类的浓度，也就可以间接反映出淀粉酶的活性，因此，可以用比色法，通过标准曲线测定淀粉酶的活性。
实验材料，仪器，试剂
（1）.材料：烟草新鲜叶片组织
（2）.仪器：a.分光光度计b.离心机c.恒温水浴锅d.具塞刻度管e.容量瓶
（3）.试剂：a.标准麦芽糖溶液（1mg/ml）；精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解，定容至100ml。
b.3，5-二硝基水杨酸（10mg/ml）；精确称取1g3，5-二硝基水杨酸，溶于20ml12mol/L的HONa溶液中，加入50ml蒸馏水，再加30g酒石酸钾钠，待其溶解后用蒸馏水定容至100ml。
c.1﹪氯化钠溶液，称取5g氯化钠于500ml容量瓶中定容。
d．1﹪淀粉溶液；称取1g淀粉溶于100ml0.1ml/L的柠檬酸钠溶液中。
实验步骤
（1）.仪器药品的准备与配置；按实验需求，将所有实验中用到的器材（大型实验设备应进行检查，做好使用前准备工作）试剂准备好
a.器材包括称量用到的分析天平以及电子天平，溶解用到的容量瓶（100ml×；1000ml×2），烧杯(包括100ml×5和500ml×1)，玻璃棒，量筒等，以及实验用的数支具塞刻度试管，将上述仪器洗净并用蒸馏水浣洗，同时检查分光光度计，离心机，恒温水浴锅等设备
b．按照要求将所需求的试剂按步骤配制好，贴好标签，待用
c．冷冻样品提前做好解冻工作
（2）．标准曲线的制作；取10支具塞刻度试管，分别编号，以1号为空白对照分别按下表加入相应试剂
编号
试剂123456789标准麦芽糖溶液（ml）02468101214163,5-二硝基水杨酸溶液（ml）222222222定容至20m1l00℃水浴锅反应5min

之后取出用流水冷却，以1号试管为空白调零点，在540nm波长下比色测定2～10号试管的OD540值，以麦芽糖含量（浓度）为横坐标，各浓度下的OD值为纵坐标，用坐标纸绘制标准曲线，求出回归方程。

（3）．酶溶液的提取；将样品分别编号，按以下步骤分别操作
a．称取2g样品于研钵中，加入少许石英砂和2ml氯化钠溶液，研磨成匀浆；
b.将匀浆转入离心管中，并用6ml氯化钠溶液分次洗涤研钵，将残渣一并洗入离心管内，于室温下放置15～20min，没隔数分钟搅动一次，使其充分提取
c．然后待全部样品按上述步骤完成后，一次性转入离心机内，以3000r/min的转速离心10min，将上清液到入100ml容量瓶中，定容，摇匀，贴上相对应于样品的编号，即为淀粉酶原液，依据实际情况做好保存工作，防止酶活性退化或酶失活

（4）．样品淀粉酶活力的测定；对于每个样品进行一下操作
取两支具塞刻度试管，编号为1和2，按下表加入以下试剂
试管编号
试剂12样品酶原液（ml）20100℃水浴锅中煮10min样品酶原液（ml）021﹪淀粉溶液（ml）2237℃水浴锅中反应10min3，5-二硝基水杨酸溶液（ml）22100℃水浴锅反应5min用蒸馏水定容至20ml，适当稀释后于540nm波长下测定OD值，以1号试管为空白调零
分别对每个样品按上述（4）步骤进行检测，记录相关数据并计算结果，将数据汇总后做成表格，
其中样品淀粉酶活力=△C×VT/(W×Vs×T)(mg/g/min)。式中，△C为从标准曲线上查得的麦芽糖含量（mg）；VT为淀粉酶原液总体积（ml）；Vs为反应所用淀粉酶原液体积（ml）；W为样品重量（g）；t为反应时间（min）。
对实验结果做出相应的分析和评价。

样品编号OD值
A=520.00nm还原糖含量
(mg/ml)酶活力(mg/g/min)WB-080.1420.7422.373WB-110.1700.9192.941WB-150.1460.7672.454WB-190.2431.3814.420WB-120.1440.7542.414WB-180.2141.1983.832WB-090.1190.5961.907WB-13(1)0.2801.6165.170WB-160.1550.8242.637WB-170.1470.7732.474WB-13(2)0.2021.1223.589WB-200.2571.4704.704WB-210.2921.6925.413WB-100.1540.8182.616
烟草中多酚氧化酶活性的测定

原理：多酚氧化酶在有氧条件下会将酚氧化为醌，醌在525nm波长下有较强的吸光值，通过测定525mn下的吸光值变化可测得多酚氧化酶

材料，仪器，试剂
（1）材料：烟草叶片组织
（2）仪器：分光光度计离心机