重组子的筛选、重组质粒的抽提、鉴定与凝胶成像技术.doc

重组子的筛选、重组质粒的抽提、鉴定与凝胶成像技术
一、目的鉴定载体与目的基因是否已经成功连接成新的重组质粒。二、原理载体pUC18具有一个EcoRI和HindIII的单酶切位点，含氨苄青霉素抗性基因。目的基因设计时分别在上、下游引物中加入了EcoRI和HindIII单酶切位点，两者双酶切后，经连接酶连接，连接成功就形成了新的重组质粒。在含50μg/mlAmp、40mlX-gal储液和4μlIPTG储液LB固体平皿上，转化平皿长出白色菌落，说明目的基因已成功插入pUC18载体的Lacz基因中，重组质粒的转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal和ITPG存在的生色诱导培养基上只能形成白色菌落。所以在含x-gal和ITPG的选择性培养基上长出的白色菌落，初步可以认为是重组转化子。为了防止假阳性的出现，需要通过重组子质粒的抽提，经EcoRI和HindIII双酶切，凝胶电泳进一步鉴定，看是否酶切为原来的载体pUC18质粒和PCR产物的分子量图谱。如果是，则认为新构建的质粒已重组成功。当然最好的鉴定方法是通过测序来确认。三、材料、试剂与器材1.高速离心机、微量移液器、1.5mlEP管2.RapidPlasmidDNADailyMini－prepKit：3.DNA－prepTube（Silica膜）4.2mlMicrofugeTube5.BufferS1（葡萄糖维持渗透压、Tris－HCl维持pH值、EDTA抑制核酸酶、RNaseA1降解RNA）6.BufferS2（NaOH裂解细胞与核酸变性、SDS裂解细胞与蛋白质变性）7.BufferS3（乙酸钾置换钠离子、冰乙酸调节pH值）8.BufferW1（乙酸钠洗脱蛋白质、糖类等大分子杂质）
四、实验步骤（一）重组质粒制备1.在5毫升LB培养液中，用微量进样器加入5微升氨苄青霉素溶液。同时挑选一个在x-gal和ITPG存在的生色诱导培养基上长出的白色单菌落，37℃援床培养过夜。2.第二天分组用1.5mlEP管收集细胞：将菌液10,000rpm离心1m，弃尽上清，重复一次，将管口倒置在纸巾上，轻轻敲击，使上清流出，管壁上不应有残留上清。3.加入250ulBufferS1，涡旋，充分悬浮细菌沉淀。悬浮需充分，对光观察，不应留有小的菌块，否则会影响菌体的裂解。4.加入250ulBufferS2，温和但充分地上下翻转4－6次，此步骤不宜超过5m。避免剧烈混合，否则将导致基因组DNA的污染。5.加入400ulBufferS3，温和地上下翻转10－20次，直至沉淀由疏松状态变为相对紧密，体积明显缩小为止，室温静置2m。12,000rpm离心10m。避免剧烈混合，否则将导致基因组DNA的污染。若离心后凝结块未沉淀沉淀到管底部，应再次翻转混合数次，12,000rpm离心3m。6.将DNA－prepTube置于2－mlMicrofugeTube中，将步骤4中的上清加入DNA－prepTube中，5,500rpm离心1m。7.弃滤液，将DNA－prepTube置回到原2－mlMicrofugeTube中，加入500ulBufferW1，5,500rpm离心1m。8.弃滤液，将DNA－prepTube置回到原2－mlMicrofugeTube中，加入500ulBufferW2，5,500rpm离心1m。重复一次。9.弃滤液，将DNA－prepTube置回到原2－mlMicrofugeTube中，12,000rpm离心2m，去除Silica膜上残余的试剂。10.将DNA－prepTube置于一洁净的1.5mlEP管中，在Silica膜中央加60ulEluent，室温静置2m，12,000rpm离心1m，洗脱质粒DNA。（二）重组质粒的酶切与检测1.用微量进样器吸取下列试剂于一个已编好号码的Eppendorf小管内（按次序一一加样）：（1）灭菌重蒸水29微升（2）中盐微缓冲夜4微升（3）重组质粒3微升（4）EcoRI与HindIII酶各2微升反应液总体积为40微升。2.把塑料小管盖紧盖子，用于指轻轻弹底部溶液，混合均匀，置于高速离心机上离心2秒钟，使反应液甩入管底部。3.将上述含有反应液的小管，置于一塑料泡沫上，放入37℃恒温水浴锅中，保温1小时。进行限制性核酸内切酶酶切反应。4.取装重组质粒的Eppdndorf管内的酶切反应液15微升，未酶切的重组质粒DNA2微升，相应Mark2微升，分别进行点样，依实验一方法，进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上拍下结果，观察酶切反应结果。6.讲解及示范凝胶成像仪的使用。五、酶切结果分析观察凝胶成像仪上的酶切图谱，讨论重组质粒是否已酶切为原来的载体pUC18质粒和PCR产物的分子量图谱，新构建的质粒是否已重组成功。六、问题如果挑取含Apm、x-gal和ITPG存在的生色诱导培养