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重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定--

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定

实验目的：

1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核

酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。

3.学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA

分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。

4.掌握利用Cacl感受态细胞的方法。
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5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6.掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大

小。

7.学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。

实验原理：

外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。

重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经

限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将

转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切

电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。

1.重组子的构建

酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一

的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基

因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶

切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，

酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。

在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体

分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。

单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最

主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先

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低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。

（要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规

模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，但是最

高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如

果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。）

连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组

技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段

相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4

噬菌体的T4DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA

的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。反应温度介

于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，用常用的连接时间为12-16h。

2.感受态细胞的制备及质粒转化

构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞

必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受

体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细

胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，

常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的

受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%
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的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过CaCl处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源
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DNA分子进入。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电

穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细

胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本

实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用CaCl处理，使其处于感受态，然后将重组后的
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PUC19质粒在42℃下