JWA基因剔除小鼠胚胎成纤维细胞.doc

JWA基因对小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化及细胞周期的影响

摘要：目的JWA基因是一个新发现的受维甲酸诱导、与细胞分化调节有关的细胞骨架样基因。本研究探讨建立JWA基因剔除小鼠MEF细胞恶性转化的细胞模型。方法选取野生型小鼠的MEF细胞和被敲除JWA基因的小鼠MEF细胞分别进行体外培养，对MEF细胞的生长形态、生长曲线等进行对比分析，推断两种细胞的增殖能力。流式细胞仪检测细胞周期改变。Westernblot法检测细胞周期蛋白表达改变。结果敲除JWA基因的MEF细胞增值速度较快，细胞数目较多。细胞周期检测可见JWA基因敲除小鼠MEF细胞中可见周期异常细胞，细胞周期蛋白cyclingD1表达升高。结论JWA基因剔除可促进MEF细胞恶性转化。
关键词MEF细胞；小鼠；JWA基因
TheeffectofJWAonmalignanttransformationandcellcycleinmouseembryonicfibroblasts(MEF)cell
Student:JiadongHuang
Guidedteacher:HongQi
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofmalignanttransformationinmouseembryonicfibroblasts(MEF)andtransformationmechanisms.MethodsWechooseMEFcellsfromwild-typemiceandmicewhoseJWAgenewasknockedout,cultureinvitro,andanalyzethegrowthmorphologyandgrowthcurveofMEFcells,thentransfertheproliferationintwokindsofMEFcells.ResultsMEFcellswhoseJWAgenewereknockoutproliferatedfaster,andthenumberofcellswasincreased.ConclusionJWAgeneinmiceisanti-cancerandanti-aginggenes.
Keywords:MEFcells;mice;JWAgene

JWA基因是在1998年从培养的原代人的气管和支气管上皮细胞中，利用差异显示反转录聚合酶链反应高通量筛选技术，分离克隆的一个受维甲酸诱导的与细胞分化调节有关的新的细胞骨架样基因，该基因登录在NCBI基因库中，其编号为AF070523[1]。JWA基因广泛存在于多种动物组织(人、鼠、猴等)和培养细胞中(S一6、HBE、H178、H358、H5935、H431、H183、H549等细胞株以及原代培养的人／猴气管支气管上皮细胞)，且大多呈高表达。JWA基因是一种环境应答基因，受多种诱导分化剂的调节，与细胞分化和凋亡相关，广泛参与细胞对应激刺激的应答，参与DNA损失和修复过程。其基因多态性与多种恶性肿瘤尤其是消化道肿瘤易感性相关[1,2]。JWA基因还与多种恶性肿瘤发生机制有关，已证实与急、慢性粒细胞白血病有明确关系。另外用A参与调节肿瘤细胞的迁移，起类似抑癌基因的作用[3]。可以相信，随着分子生物学的不断发展和对该基因的更深人的研究，对关于JWA抑制肿瘤细胞迁移的确切机制、其在恶性肿瘤发生，发展和转移过程中的作用、是否能成为观察肿瘤患者预后及转移的指标等问题都将得到揭晓。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物:清洁级BALB/c小鼠，6～8周龄。购回后饲养观察1～2周，选取精神状况良好的雌、雄鼠，按3:l比例合笼，次日早8:00前检查，有阴道栓者记为妊娠0.5d，以此推算雌鼠怀孕日龄，实验过程中选择不同孕期雌鼠获取胚胎。
1.1.2实验试剂：DMEM(GIBCO公司产品)，胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(SIGMA公司)，新生牛血清(GIBCO公司)，高糖DMED培养基、0.25％胰蛋白酶；00.02％EDTA(GIBCO公司)；β—半乳糖苷酶细胞衰老染色试剂盒；Ⅱ紫外交联仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)，琼脂、胎牛血清(FCS)，3％戊二醛固定液、瑞氏、吉姆萨染液等。
1.2方法
1.2.1原代MEF分离培养[4]：将孕鼠处死，取出子宫，PBS洗涤，除去血迹。剪开子宫，撕破胎膜，取出胎鼠，PBS洗涤。将胎鼠躯干剪成1mm以下的碎块，吸置于离心管内，静置5～10min，弃去上层液体。装有鼠胚组织碎块的离心管内加入1ml消化液，轻轻吹吸30s，加入等体积培养液终止消化，室温下静置5～10min，收集上层细胞悬液。重复操作1次，弃去组织块。将收集到的细胞悬液800～1000r/min离心5min，弃去上清。培养液重悬细胞至培养