毕赤酵母高密度发酵工艺的研究_林俊涵.pdf

中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2009,29(5):120～125

毕赤酵母高密度发酵工艺的研究

林俊涵3
(福建生物工程职业技术学院福州350002)

摘要高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略,发酵工艺是高密度发酵的一个
重要因素。采用下列措施均可以有效地提高表达水平:调节基础培养基,采用变pH和变温发酵,
提高DO,选择最适的诱导前菌体密度和比生长速率并降低甘油初始浓度和采用分段式指数流加
进行调控。选择合适的甲醇补料策略:甲醇限制补料(MLFB)、氧气限制补料(OLFB)、甲醇不限
制补料(MNLFB)和温度限制补料(TLFB)。采用两种方式调控补料:诱导阶段菌体生长时,甲醇
-1-1
比消耗速率(qMeOH)为0.02-0.03ggh,而菌体不生长时,qMeOH采用较高值。
关键词毕赤酵母高密度发酵发酵工艺
中图分类号Q815

巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)是一种能高效表同时补加PTM1微量盐溶液。许多外源蛋白通过BSM
达外源蛋白的表达系统,具有遗传稳定、表达水平高、获得有效表达,但有些蛋白则效果不好,甚至不表达,
蛋白可翻译后加工、产物可分泌、可高密度发酵等许多因此,在表达不同蛋白时,需对BSM进行优化。
优点[1],应用十分广泛,已有数百种外源蛋白在该系统1.1碳源的优化
中获得表达。甘油是菌体生长阶段普遍采用的碳源,通过补料
高密度发酵是基因工程菌提高外源蛋白表达水平加入培养基,其浓度过低或过高会限制或抑制菌体生
的一种重要策略,迄今,已有许多蛋白通过高密度发酵长,因此,需要优化初始甘油浓度,选择有效的补料方
获得高表达量,如巴西三叶胶腈水解酶的表达量高达式。葡萄糖也可作为碳源,虽效果不如甘油,但性价比
22g/L[2],植酸酶表达量达12.2g/L[3],SAM表达量达却优于甘油,以葡萄糖代替甘油将有利于工业化生
[6]
[4][5]产。
11.63g/L,1,321,42β2D2葡聚糖酶表达量达3g/L
甲醇是诱导表达阶段的碳源其浓度()和补
等。但是,不同外源蛋白的表达水平相差很大,引起这,CMeOH
料方式是关键。过低会限制菌体生长和诱导强
种差异的重要因素有二:一是重组菌本身特性,如基因CMeOH,
度过高则对菌体产生毒性。甲醇最佳浓度一般
本身特性、基因拷贝数、密码子使用频率等,二是发酵;CMeOH,
[7]
工艺。目前,针对甲醇毕赤酵母高密度发酵,业界已建在0.5%～3%(v/v),但有些蛋白高于3%,因此,不
立起较为成熟的补料分批发酵和连续发酵两种方式,同蛋白的最佳浓度不同,需通过实验并结合补料策略

主要针对补料分批发酵工艺的影响和调控进行阐述。确定。CMeOH通过补料调节并保持恒定,其检测控制方
法有溶氧反馈控制、甲醇离线控制和在线控制,而甲醇
1培养基组成的优化及调控在线控制最优[8]。

培养基是高密度发酵的基础,直接影响菌体生长1.2氮源的优化
氨水常作为氮源并用于调节其释放的+
和诱导表达,现在大多采用Invitrogen公司提供的复合,pH,NH4
培养基如BMGY/BMMY、BMG/BMM、MGY/MMY和基浓度对菌体生长、蛋白表达和降解有重要影响。浓度
础盐培养基BSM,后者较便宜,一般用于发酵罐发酵,过低,限制菌体生长,并增加蛋白的降解;浓度过高,虽
可减少蛋白降解,却会抑制菌体生长和蛋白表达。因
收稿日期:2008209216修回日期:2008210217
+
3电子信箱:[e-mail]此,NH4浓度需要优化,并采用恒浓度或变浓度法调

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2009,29(5)林俊涵:毕赤酵母高密度发酵工艺的研究121

[9]+[16]
控。谢静莉等在发酵后期添加(NH4)2SO4,使NH4pH由3升至7时,rHSA的降解逐渐减少。因此,必
浓度维持在150mmol/L以上,蛋白表达量提高58.8%。须选择合适的pH,一般在3.0～7.0,而且在不同阶段,
[4]+
Zhang等将NH4浓度维持在0.45mol/L时,菌体生应选择不同pH,采用变pH发酵。在表达猪胰岛素前
长不受影响,SAM表达量最高,诱导时间比之前报导的体时,菌体生长和诱导表达的最适pH分别为5.5和
[10]+[17]
缩短43h。Yang等研究表明:NH4初始浓度为4.0,表达量比pH6.0提高1.2倍。pH一般是通过
+
0.4mol/L时,水蛭素表达量最高;在0.6mol/L时,降解补加氨水来调节,若NH4浓度过高,则改为补加碱来
+
程度最低,但抑制菌