微卫星引物筛选步骤.doc

1．进行酶切
用VspⅠ对四种鱼（GC、GS、NL和ZZ）基因组DNA（需基因组DNA浓度较高）进行酶切。
反应体系为：ddH2O15µL
VspⅠbuffer2µL
VspⅠ酶1µL
DNA2µL
总体积20µL
酶切在37℃反应3～4h即可，但是为了提高酶切效率可切4～6h。
PCR反应程序为：94℃5min，（94℃1min，53℃1min，72℃1min）×30，72℃10min，4℃hold。
VspⅠ酶即（AseⅠ酶）：酶切识别位点为：5’AT↓TAAT3’
5’TAAT↑TA3’
AseⅠ酶的接头为：
A1：5’CTCGTAGACTGCGTACC3’
A2：5’TAGGTACGCAGTC3’
AseⅠ酶用的预扩增产物为：
A3：5’CTCGTAGACTGCGTACCTAAT3’
2．接头制备
用10µLA1（200µM）和10µLA2（200µM）混合，94℃3min后室温放置30min。
3．酶切片段与接头连接
接头为A1和A2制备的接头，命名为AE。连接反应体系如下：
ddH2O5µL
T4ligation酶0.5µL
T4buffer4µL
酶切产物20µL
ATP（10mM）0.3µL
AE1µL
总体积30.8µL
上述混合体系在16℃连接过夜。10h左右。
4．连接产物PCR扩增
对连接产物进行PCR扩增，每个样本做4管。扩增引物为A3。反应体系如下：
ddH2O14µL
10×buffer2.5µL
Mg2＋2µL
dNTPs（10mM）0.5µL
A31µL
DNA（连接产物）5µL
TaqE（2.5U/µL）0.2µL
总体积25.2µL
PCR反应程序为：（94℃30sec，56℃1min，72℃1min）×20，72℃10min，4℃hold。
5.检测扩增产物
扩增产物大小应在750bp左右，即400～1000bp较好。
6．回收扩增产物
将同一样本的扩增产物收集于一个EP管中
↓
向其中加入1/10总体积预冷的3MNaAC和2倍体积预冷的无水乙醇
（或者等体积预冷的4MNH4AC和2倍体积预冷的异丙醇）
↓
－20℃放置30min（该步可在－20℃长期保存）
↓
室温，12000rpm离心10min
↓
弃上清，加入1ml左右70％乙醇洗涤一次
↓
室温，12000rpm离心5min
↓
弃上清，干燥后加入20µLddH2O溶解即可（可以根据沉淀量加入ddH2O）
7．配杂交体系
取250～500ng回收DNA与50～80pmolbio-SSR探针混合，使SSC和SDS终浓度分别为4.2×SSC和0.07%SDS。具体杂交体系如下：
ddH2O74.5µL
20×SCC21µL
10%SDS0.7µL
回收产物3µL
bio-SSR探针（AC）150.8µL
总体积100µL
PCR反应程序为：95℃5min，在58℃可以保存，但是不能时间长。在此过程中可以准备磁珠。
bio-SSR探针序列可以为（AC）10、（AC）15、（AC）12或者AG重复均可，这个可以根据基因组序列确定。
8．磁珠准备
1）2mgbeads（200µL）（根据DNA沉淀的多少决定所用磁珠的量，在100～200µL之间，在解冻磁珠时应轻柔的上下颠倒，不能用力）放置在磁力架上，使其吸附到EP管的一侧，然后从另一侧吸弃清液，再加入1mLTEN100洗涤，轻柔颠倒混匀，使磁珠和TEN100充分混合2min左右，然后放到磁力架上吸附，如此反复3次即可。
2）用40µLTEN100溶解最后一次聚集的磁珠。
3）为减少特异性吸附向上述混合液中加入2µL与之无关的基因组DNA（如植物基因组）。
9．吸附
1）将杂交体系与稀释的磁珠混合，再加入200µLTEN100稀释。
2）室温放置30min，期间轻柔混合（不能用力过猛，因为该过程是目的片段与探针吸附）。
10．洗涤(去掉多余DNA和杂质)
将吸附好的磁珠放到磁力架上去除上清。
1）松弛型洗涤：400µLTEN1000洗涤3次，每次5min，加入TEN1000后轻柔混匀。
2）严谨型洗涤：12µL20×SSC＋12µL10％SDS＋1176µLddH2O，400µL/次，洗涤3次，每次5min，其间需轻柔混匀。（使SSC终浓度为20％，SDS为0.1%）。
11．洗脱
1）第一次洗脱：在磁力架上弃上清液，向磁珠中加入50µLTE，95℃5min后迅速取出将上清液吸入另一个管子中（若温度降低那么则会复性），放入－20℃保存。
2）第二次洗脱：向第一次洗脱后的磁珠中加入12µL0.15MNaOH,洗脱20min后，将其放在磁力架上，取一侧清液，向清液中加入1.8µL1MHCL，再加入36.2µLTE，总共50µL后，放入－20℃保存。
3）洗脱产物回收：分别对两次洗脱后的产物进行