抗体HRP标记方法.doc

HRP标记抗体的方法(戊二醛二步法和简易过碘酸钠法)
一、戊二醛二步法戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。二、简易过碘酸钠法本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70%的HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。
1.原理
戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-419.html"\t"_blank"免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-419.html"\t"_blank"免疫球蛋白结合物。
2.标记步骤
（1）称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
（2）反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-912.html"\t"_blank"烧杯中，缓慢搅拌。
（3）将待标记的HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-383.html"\t"_blank"抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
（4）用1MPH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。
（5）加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
（7）3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。
（8）将上述溶液装入HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-975.html"\t"_blank"透析袋中，对0.15MPH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
3.结果判定
（1）定性及效价滴定：用特异性抗原(或HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-383.html"\t"_blank"抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-642.html"\t"_blank"琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定(见本节(三)工作浓度的选择)。
（2）定量和克分子比值测定：可用HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-230.html"\t"_blank"分光光度计测定(光程1cm)。
酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4
IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
（3）本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2-4%的酶与蛋白质结合。
4.试剂及器材
（1）0.1MPH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2MNa2HPO449ml,0.2MNaH2PO451ml，NaCl1.8克，加HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-67.html"\t"_blank"蒸馏水至200ml。
（2）1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。
（3）1MPH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
（4）0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01MPH9.5碳酸缓冲液1ml中。
（5）0.15MPH7.4PBS及生理盐水。
（6）PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
（7）萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
（8）纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。
（9）HRP(RZ>3.0)。
（10）SephadexG-25层析柱(2cm×50cm)。
（11）HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-51.html"\t"_blan