一种HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体及其制备方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114891113A(43)申请公布日2022.08.12(21)申请号202210446881.4G01N33/577(2006.01)(22)申请日2022.04.26(71)申请人四川农业大学地址625000四川省雅安市雨城区新康路46号(72)发明人罗燕任梓薇程建国付文龙周磊吴杰刘洁(74)专利代理机构北京正华智诚专利代理事务所(普通合伙)11870专利代理师王玲玲(51)Int.Cl.C07K16/42(2006.01)C07K1/13(2006.01)C12N5/20(2006.01)G01N33/535(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图1页(54)发明名称一种HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体及其制备方法(57)摘要本发明提供了一种HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体及其制备方法，通过多次筛选和亚克隆以获得能够稳定分泌特定抗体的杂交瘤细胞，再通过该细胞最终制得HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体，该方法能够稳定且高效的制得该HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体，能够有效解决现有的酶标抗体与林麝血清特异性结合效果差且效价较低的技术问题。CN114891113ACN114891113A权利要求书1/2页1.一种HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：提取林麝体内的免疫球蛋白G，得到林麝IgG，将所述林麝IgG与弗氏佐剂混合后对多只BALB/c小鼠进行动物免疫再测定多只所述BALB/c小鼠的抗体效价，选取所述抗体效价最高的BALB/c小鼠并取其脾脏破碎，得到B细胞；复苏小鼠骨髓瘤细胞，制备饲养层细胞，将复苏后的所述小鼠骨髓瘤细胞和所述B细胞进行细胞融合，得到融合细胞，将所述融合细胞和所述饲养层细胞混合培养，再筛选所述融合细胞内的阳性杂交瘤细胞，对所述阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，得到亚克隆细胞；将所述亚克隆细胞分别接种于多只所述BALB/c小鼠体内，待多只所述BALB/c小鼠的腹腔胀大后抽取腹水，对所述腹水进行纯化，得到纯化抗体；将所述纯化抗体用LinKineTM辣根过氧化物酶偶联试剂盒标记后加入HRPlabeling溶液、ActivatedHRP溶液和去离子水避光反应后得到粗品，向所述粗品中加入quencher溶液后即得到所述HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述动物免疫包括初次免疫，所述初次免疫包括如下步骤：用90‑110μL浓度为3‑5mg/mL的所述林麝IgG与等体积的弗氏完全佐剂混合后皮下注射于所述BALB/c小鼠体内免疫14d，注射量为0.2‑0.3mL/只。3.根据权利要求2所述的HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述动物免疫还包括二次免疫、三次免疫和四次免疫，所述二次免疫包括如下步骤，在所述初次免疫后，用90‑110μL浓度为3‑5mg/mL的所述林麝IgG与等体积的弗氏不完全佐剂混合后皮下注射于所述BALB/c小鼠体内免疫14d，注射量为0.2‑0.3mL/只；所述三次免疫和所述四次免疫的步骤与所述二次免疫相同。4.根据权利要3所述的HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体的制备方法，其特征在于，还包括加强免疫，所述加强免疫包括如下步骤：在所述测定多只所述BALB/c小鼠的抗体效价后，在每只所述BALB/c小鼠的腹腔注射90‑110μL浓度为3‑5mg/mL的所述林麝IgG，所述注射量为0.2‑0.3mL/只。5.根据权利要求1所述的HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述小鼠骨髓瘤细胞的复苏包括如下步骤：于所述细胞融合前的7‑14d用含1％wt的青链霉素和20％wt的胎牛血清的DMEM细胞完全培养液培养所述小鼠骨髓瘤细胞至所述小鼠骨髓瘤细胞于所述细胞融合时刚好处于对数生长期。6.根据权利要求1所述的HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述饲养层细胞为未免疫的所述BALB/c小鼠的腹腔内巨噬细胞，所述饲养层细胞的制备在所述细胞融合前12‑24h。7.根据权利要求1所述的HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述细胞融合时，所述小鼠骨髓瘤细胞与所述B细胞的数量比为1：(5‑10)。8.根据权利要求1所述的HRP标记鼠抗林麝IgG单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述纯化抗体的制备包括如下步骤：取健康BALB/c雌性小鼠多只，每只腹腔注射0.4‑0.6mL液体石蜡，7‑14d后得到预处理小鼠；取所述阳性杂交瘤细胞于800‑1200r/min离心5min，弃上清液，收集沉淀并用生理盐水重悬，调整细胞数量至106个/mL，得到待注射细胞，向每只所述预