纤维蛋白沉积对老年急性肺损伤大鼠肺组织内皮细胞功能的影响.doc

【摘要】目的探讨纤维蛋白沉积对不同鼠龄大鼠肺组织血管内皮细胞功能的影响。方法青年及老年大鼠均随机分为4组，对照组(NC)腹腔注射生理盐水；脂多糖组(L)腹腔注射脂多糖；氨甲环酸组(LT)注射脂多糖加氨甲环酸；尿激酶组(LTU)注射脂多糖及氨甲环酸加尿激酶。应用免疫组化分析纤维蛋白沉积；应用Westernblot和Northernblot分别检测肺组织血栓调节蛋白(TM)、细胞间黏附分子1(ICAM1)、纤溶酶原激活剂抑制物1(PAI1)的表达。结果(1)正常青年和老年大鼠肺组织内均无纤维蛋白沉积，脂多糖刺激后纤维蛋白沉积增多，加用氨甲环酸纤维蛋白沉积更加明显(P＜001)，应用尿激酶后纤维蛋白沉积明显减轻(P＜005)；老年大鼠L组、LT组和LTU组均比相同干预组的青年大鼠肺组织纤维蛋白沉积明显(P＜005)。(2)青年和老年大鼠给与脂多糖刺激后，ICAM1和PAI1表达明显上调(P＜005)，TM表达显著下降(P＜001)；加用氨甲环酸后ICAM1和PAI1表达上调更加明显(P＜001)，TM几乎无表达；给予尿激酶处理后，ICAM1和PAI1表达与LT组比较明显下调(P＜005)，TM表达增多(P＜005)；老年大鼠L组、LT组和LTU组ⅠCAM1和PAI1的表达均较青年大鼠相同干预组显著增多(P＜005)，TM表达则显著减少。(3)经纤维蛋白沉积量校正后，老年大鼠肺组织ICAM1和PAI1的表达量仍显著高于青年大鼠(P＜005)。结论增龄能够促进脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠肺组织纤维蛋白沉积,增强纤维蛋白的内皮细胞损伤作用。

【关键词】纤维蛋白；肺；炎症；内皮细胞

外界有害刺激和炎症介质可直接激活内源性凝血通路，导致纤维蛋白沉积〔1〕。肺组织内大量纤维蛋白沉积是多种原因导致的肺部炎症的重要病理特征，目前研究表明纤维蛋白沉积不仅仅是病理损伤产物，体外实验发现纤维蛋白具有内皮细胞损伤作用〔2，3〕，但其在体内的作用并不清楚。本研究应用脂多糖诱导急性肺损伤动物模型〔4〕，用氨甲环酸和尿激酶调控纤维蛋白沉积水平，观察纤维蛋白沉积对不同鼠龄大鼠肺组织血管内皮细胞功能的影响。

1材料与方法

11实验动物及模型制备选用健康雌性3月龄Wistar大鼠(青年鼠)32只，平均体重(220±20)g(北京试验动物中心提供)；27月龄雌性Wistar大鼠(老年鼠)32只，平均体重(420±20)g，(解放军总医院实验动物中心提供)。适应性喂养1w后，青年鼠和老年鼠分别随机分为正常对照组(C组)、脂多糖组(L组)、脂多糖+氨甲环酸组(LT组)、脂多糖+氨甲环酸+尿激酶组(LTU组),每组8只。参照文献方法，以脂多糖(LPS，Escherichiacoliserotype055∶B5,Sigma,USA)14mg/kg腹腔注射诱导大鼠急性肺损伤模型。NC组大鼠腹腔注射生理盐水30ml；L组大鼠单纯腹腔注射LPS；LT组大鼠腹腔注射LPS30min后，给与氨甲环酸腹腔注射(湖南洞庭药业股份有限公司，批号021002)；LTU组大鼠腹腔注射LPS30min后腹腔注射氨甲环酸，60min后股静脉注射尿激酶2500U/kg(丰原药业马鞍山药厂产，国字准字H34021690)。所有大鼠均于LPS注射4h后，用10%水合氯醛(04ml/kg)腹腔注射麻醉，处死留取标本。所取肺组织1/3用10%甲醛固定制备石蜡包埋切片，其余肺组织立即置于液氮冷冻，随后-70℃冰冻保存以作RNA、蛋白质等分析。

12主要试剂内毒素(LPS，O55B5)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、抑胰肽酶(aprotinin)、亮肽素(leupeptin)购自Sigma公司；ACTIN多抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、兔抗羊IgG、羊抗大鼠MCP1单克隆抗体、ECL显色系统均购自美国SantaCruz公司；Trizol试剂购自美国TEL2TESTInt公司；考马斯亮兰G2250购自北京邦定泰克生物技术公司；随机引物标记试剂盒购自宝灵曼公司。

13肺组织纤维蛋白免疫组化检查组织蜡块2μm切片，常规脱蜡，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10min。005%胰酶37℃抗原修复10min，血清封闭20min(室温)。加入纤维蛋白抗体4℃孵育过夜。次日用PBS漂洗后加入生物素标记的山羊抗兔抗体室温孵育20min。PBS漂洗后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温孵育20min。PBS漂洗，DAB显色，苏木素复染细胞核，脱水、透明、中性树胶封片。空白对照片不加一抗，其余步骤同上。应用Imageproplus51软件进行图像分析。免疫组化染色切片在光镜下放大400倍，每张切片随机选取20个不重叠视野，测定每个视野棕黄色(