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急性肺损伤大鼠肺组织神经导向因子Slit2及Robo4的表达急性肺损伤大鼠肺组织神经导向因子Slit2及Robo4的表达.doc

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描述：目的观察神经导向因子Slit2及Robo4在肺组织的表达并探讨二者在ALI发病中的作用。方法在南华大学实验动物部将48只SD雄性大鼠随机（随机数字法）分为对照组（n=24）与ALI组（n=24）。... 【摘要】目的观察神经导向因子Slit2及Robo4在肺组织的表达并探讨二者在ALI发病中的作用。方法在南华大学实验动物部将48只SD雄性大鼠随机（随机数字法）分为对照组（n=24）与ALI组（n=24）。ALI组采用盲肠结扎穿孔术复制急性肺损伤模型，对照组只开腹关腹，不行盲肠结扎穿孔术，以血清炎症因子浓度、动脉血氧分压（PaO2）、组织水肿、肺部特征性病理改变作为ALI模型成功主要指标。两组又分为术后12、24、48h3个组，每组8只。取大鼠动脉血测定PaO2；取肺组织测定湿/干质量（W/D）比值，并观察肺毛细血管通透性及组织病理学改变；ELISA检测血清TNF-α水平；RT-PCR测定肺组织Slit2及Robo4mRNA表达，免疫组织化学法观察蛋白表达情况。采用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。结果与对照组比较，ALI组致伤后各时间点PaO2均降低，肺W/D比值、肺毛细血管通透性、血清TNF-α水平均升高（P<0.05），病理观察显示肺组织受损；RT-PCR结果显示ALI组12h，24h，48h肺组织Slit2mRNA表达量较同期对照组下降[（0.56±0.13）vs.（0.87±0.05），F=41.39，P<0.05，（0.42±0.10）vs.（0.85±0.07），F=93.54P<0.05，（0.26±0.08）vs.（0.89±0.09），F=227.05，P<0.05]；ALI组肺组织Robo4mRNA表达量与同期对照组比较，差异无统计学意义[（0.86±0.07）vs.（0.83±0.05），F=0.695，P>0.05，（0.82±0.05）vs.（0.89±0.08），F=2.061，P>0.05，（0.85±0.08）vs.（0.86±0.05），F=0.035，P>0.05]；免疫组织化学研究显示Slit2主要表达于内皮细胞膜上，亦可表达于肺上皮细胞胞核及胞浆，Robo4则只表达于内皮细胞膜上；ALI组3个时间点肺组织Slit2蛋白表达量较同期对照组下降[（0.37±0.05）vs.（0.45±0.07），F=6.82，P<0.05，（0.32±0.06）vs.（0.47±0.09），F=23.54，P<0.05，（0.28±0.07）vs.（0.46±0.06），F=28.01，P<0.05]；与对照组比较，ALI组肺组织Robo4蛋白表达量差异无统计学意义[（0.53±0.04）vs.（0.52±0.05），F=0.155，P>0.05，（0.53±0.09）vs.（0.50±0.05），F=0.498，P>0.05，（0.55±0.06）vs.（0.56±0.07），F=0.073，P>0.05]。结论对照组大鼠肺组织可表达Slit2及Robo4，盲肠结扎穿孔致ALI大鼠肺组织Slit2表达下降，这可能与ALI发病有关。 临床上脓毒症作为ALI/急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS）的间接诱因，常可伴发ALI/ARDS。随着肺保护性通气策略的推广，ALI的病死率已趋下降，但仍高达30%～40%。MacSweeney等研究发现，在早期对ALI进行积极治疗，能够有效阻断MODS中各器官衰竭的序贯进行，从而提高危重症患者的治愈率。以往对于ALI发病机制的研究集中在“瀑布样”炎症反应导致肺上皮细胞及血管内皮细胞受损。分泌性糖蛋白Slit与其配体Robo最初只被定义为神经导向因子中的一员，2010年，Lee和Slutsky研究发现Slit2/Robo4信号通路与白细胞的迁移、血管的生成及维持内皮功能的稳定有一定的关系，但对Slit2及Robo4在急性肺损伤发病机制中的作用方面的研究尚不多。本研究通过观察ALI大鼠肺组织神经导向因子Slit2及Robo4的表达，探讨二者在脓毒症ALI发生、发展中的作用。1材料与方法1.1主要材料清洁级雄性SD大鼠48只，体质量（250±20）g，购自南华大学实验动物部。TNF-α、IL-6（ELISA）试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；伊文思蓝（大连美仑生物科技有限公司）。Trizol（美国Invitrogen公司），cDNA逆转录试剂盒（美国fermentas公司），内参照β-actin，Slit2和Robo4的特异性引物（上海桑尼生物科技有限公司），兔抗大鼠Slit2多克隆抗体及兔抗大鼠Robo4多克隆抗体（北京博奥森生物有限公司）。PCR扩增仪（美国Axyg