miRNA用荧光定量PCR检测的完整流程.doc

一、miRNA简介
小RNA是19~28nt的调控RNA分子，主要包括微RNA(microRNA，miRNA)和小干涉RNA(shortinterferingRNA，siRNA)两类，其中的miRNAs成为继siRNAs之后新的研究热点之一，名列2002年和2003年美国《科学》杂志评出的年度十大科学成就。
miRNAs是长片段RNA序列的一部分，同siRNAs一样是比较短小的单链小分子RNA，一般来源于染色体的非编码区域，由大约70nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来，它通过与其目标mRNA分子的3端非编码区域(3-untranslatedregion，3UTR)互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制。
在miRNA公共数据库miRBase(http://www.mirbase.org/)中已经有1W多条来自不同物种的miRNA序列。

MiRNA检测方法
要了解miRNA在基因调控中扮演的角色，很关键的一个方法就是迅速、准确地定量检测miRNA基因的表达。因此，miRNA表达水平的检测也成为了科学家们研究的热点。但是由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。常用的检测方法有：
1.1Northernblotting
1.2核糖核酸酶保护分析以及基于此方法的液相杂交。
1.3RT-PCR也被用来检测miRNA前体的表达水平，其他基于PCR技术检测miRNA的方法有：引物延伸法，就是在引物的5末端加一个特异标记，可以定量测定低丰度的RNA含量；原位杂交技术（CISH,FISH）可以方便的检测miRNA的时空表达的差异。
1.4芯片(microarrays)技术[46,47]是一种较快的研究miRNA表达的方法。
二、反转录引物分类以及设计原理
Real-timePCR方法克服了由于miRNA分子太短（~22nt）带来的定量最大难题而引入靶向特异性的反转录引物，该RT引物可以与成熟miRNA结合，形成反转录引物/成熟miRNA复合物，并在miRNA的5’末端延伸。这样就得到一个较长的反转录扩增因子，为进一步做实时定量PCR提供了符合要求的摸板。

RT引物有两种类型：
1、Oligod(T)特异的RT引物（QIAGEN产品为主）
由特异序列＋(T)20左右＋兼并碱基V或VN组成。（所有miRNA可以公用一个Oligod(T)的RT引物，但是RNA在反转录前需要进行末端Poly(A)加尾）
2、茎环状结构的RT引物（ABI产品为主）
由可以自身呈环茎状的特异序列＋6到8个miRNA3’端反向互补碱基组成。(一条miRNA序列特异对应一个茎环状结构的RT引物）。
三、引物探针设计
由于反转录后得到的cDNA为（miRNA+RT引物）复合片段。
上游引物可以在miRNA自身序列上找，如果GC含量太低，可以在上游引物5’端加入GCGCC等的保护碱基；下游引物在RT引物的反向互补序列中找；也就是说：上游引物是每个miRNA所特有的，下游引物为通用引物就可以了。
荧光定量PCR检测方法有SYBRGreen染料法和TaqMan探针法。前者需要调整引物浓度以及引物扩增效率，把引物二聚体调整到越小越好；探针法则需要设计荧光探针，这其中由于MGB探针需要碱基数量少和特异性好的特点而被推荐（非广告）。
探针设计位置有3个：完全与miRNA序列相同、在miRNA与RT引物的交叉点、完全在RT引物上；这其中又有正向和反向互补两种情况。至于探针要设计在那个位置，根据自己试验情况而定，本人以为效果都差不多。

四、试验操作流程
1、RNA提取
在以上两种RT引物中，Ologod(T)特异引物所需要的RNA尽量是用特殊试剂盒提取的小RNA，而茎环状结构RT引物需要RNA正常提取就好。
另外由于所需样本不同RNA提取方法也不完全相同，普通组织样本和细胞可以研磨用Trizol＋氯仿抽提；血液和植物样本需要前期处理后再用Trizol＋氯仿或用专门的Kit抽提。
2、反转录
确认用Oligod(T)特异RT引物时，RNA需要进行3'Poly(A)加尾处理。
反转录的酶没有特殊要求，操作请按照各自反转录酶的说明书进行就好。这里特别注意的是：反转录过程中用到的RT引物（常规的是随机引物、Oligod(T)和特异引物）是前面提到的Ologod(T)特异引物和茎环状结构RT引物，它们分别属于Oligod(T)和特异引物范畴，在反转录中不需要另外添加其他RT引物。
在确定反转录温度中请特别注意您使用的是哪一种RT引物，而设定相应的反转录温度。
3、荧光定量PCR
优化PCR体系（引物浓度、Mg浓度、dNTP浓度、退火温度等），正常操作。