Mitotracker 染色操作流程曹海燕.docx

Mitotracker染色实验操作流程

1. 将细胞种植在confocal专用DISH里，密度为2×104；37℃培养，24-36h等细胞完全贴壁后染色。
2.准备好无血清培养基、移液器、枪头、避光盒等需要仪器；
3.将mitotracker染色试剂用无血清培养基按1：5000的比例稀释，DAPI试剂（罗氏公司）用无血清培养基按1:1000比例稀释，然后放37℃孵箱里预热10min。
4.移去DISH里的培养基，加少量无血清培养基冲洗三次，去除残余含血清的培养基；
5.每个DISH钟加入500ul预热的染色液，放37℃孵箱里孵育20-25min（避光操作）。
6.加入DAPI染色液，500ul/dish，室温避光孵育10min。
7.移去染色液，加入少量无血清培养基冲洗三次，最后加入500-1000ul无血清培养基孵育细胞，准备用激光共聚焦显微镜拍照。
注：整个染色过程都要注意避光，避免荧光淬灭，影响染色效果。

Mito-TrackerGreen(线粒体绿色荧光探针)产品简介Mito-TrackerGreen是一种线粒体(mitochondria)绿色荧光探针，可以用于活细胞线粒体特异性荧光染色。Mito-TrackerGreen为采用MolecularProbes公司的carbocyanine进行了荧光标记的一种Mito-Tracker，分子量为671.88，可以用作线粒体特异性的荧光探针。和rhodamine123或JC-1相比，Mito-TrackerGreen对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位。Mito-TrackerGreen可以用于对活细胞的染色，但染色后如果固定会导致染色消退。Mito-TrackerGreen呈绿色荧光，检测时的最大激发波长为490nm，最大发射波长为516nm。按最终工作浓度为20-200nM计算，可以配制约370-3700mlMito-TrackerGreen工作液。。

Theory：MitoTracker®Dyes—FixableProbesAlthoughconventionalfluorescentstainsformitochondria,suchastetramethylrosamineandrhodamine123,arereadilysequesteredbyfunctioningmitochondria,thesestainsareeasilywashedoutofcellsoncethemitochondriaexperiencealossinmembranepotential.Thischaracteristiclimitstheuseofsuchconventionalstainsinexperimentsthatrequirecellstobetreatedwithaldehydefixativesorwithotheragentsthataffecttheenergeticstateofthemitochondria.Toovercomethislimitation,MolecularProbesofferstheMitoTracker®probes—aseriesofpatentedmitochondrion-selectivestainsthatareconcentratedbyactivemitochondriaandwellretainedduringcellfixation.1Thecell-permeantMitoTracker®probescontainamildlythiol-reactivechloromethylmoietythatappearstoberesponsibleforkeepingthedyeassociatedwiththemitochondriaafterfixation.Tolabelmitochondria,cellsaresimplyincubatedinsubmicromolarconcentrationsofaMitoTracker®probe,whichpassivelydiffusesacrosstheplasmamembraneandaccumulatesinactivemitochondria.Oncetheirmitochondriaarelabeled,thecellscanbetreatedwithanaldehyde-basedfixativetoallowfurtherprocessingofthesample.BecausemostoftheMitoTracker®probesarealsoretainedafterpermeabilizationwithdetergentsororgani