第二章 微生物的纯培养和显微技术.ppt

第二章微生物的纯培养及显微技术第一节微生物的分离和培养无菌技术
用固体培养基分离纯培养
用液体培养基分离纯培养
单细胞（单孢子）分离
选择培养分离
微生物的保藏技术
一、无菌技术1、微生物培养的常用器具：试管、三角瓶、培养皿等2、保持无菌的方法

高压蒸气灭菌（最常见）
高温干热灭菌
棉塞
超净工作台
无菌接种接种操作
火焰（酒精灯等）附近二、用固体培养基获得纯培养同一细菌在不同培养基上形成不同菌落特征平板分离微生物纯培养技术（原理及方法）1、稀释倒平板法（倾注平板法pourplatemethod）十倍稀释法优点：适合分离和计数目的

局限：操作麻烦；
不合适热敏感菌；
不适合严格好氧菌；
同一微生物，培养基内外形成菌落形态差异
2、涂布平板法（spreadplatemethod）优点：简单易行；常规用法

局限：涂布不均与；
易造成机械损伤稀释倒平板法&涂布平板法3、平板划线法（streakplatemethod）划线方法特点：快速、方便。
分区划线（适用于浓度较大的样品）
连续划线（适用于浓度较小的样品）厌氧罐厌氧手套箱密封容器除氧方法化学方法
化学吸氧法——利用化学反应耗氧达到形成厌氧环境的目的。
用焦性没食子酸（1g）与NaOH（10%）反应除氧（100ml空气中的O2）。
密闭容器中利用硫磺或磷的燃烧耗氧形成厌氧环境
NaHSO3+NaCO3混和反应耗氧
培养基预还原法
培养基中加入还原剂（半胱氨酸、Na2S、Vc）再隔绝空气培养，适于培养专性厌氧菌。

稀释摇管法（shaketubemethod)特点：严格厌氧菌分离技术；
适用缺乏专业设备的情况

局限：观察和挑取菌落难三、用液体培养基获得纯培养四、显微单细胞（单孢子）分离法五、选择培养分离
高温条件下分离高温菌；
培养基添加抗生素，分离抗性菌；
培养基中不含N，分离固氮菌
2、富集培养
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物
如果要从环境中分离得到仅能够利用苯作为碳源和能源的微生物纯培养物，你该如何设计实验方案？二元培养物六、微生物的保藏技术1、传代培养保藏法
是微生物保存的基本方法。
琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等。
橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温保存
4-6℃保存。

斜面低温保藏法
原理：低温
方法：将菌种接种在新鲜斜面培养基上适温培养至生长完全4℃冰箱保藏每隔一段时间移接一次优点：适用于各种微生物；简便易行；易于观察；
缺点：保藏时间短；传代次数多；易变异；易污染、

保藏时间：霉4个月酵4—6个月放3个月细1—2个月2、石蜡油封藏法
原理：低温、缺氧
方法：将无菌石蜡油注入生长良好的斜面种试管内（油量高出斜面1cm）包扎后竖直放入冰箱保藏。

说明：
保藏时间1—2年；
斜面培养基能干燥则保藏效果好；
适于各种微生物，尤其适合丝状真菌和担子菌
能同化和敏感烃类的微生物不宜用此法。
3、砂土管保藏法（干燥-载体保藏）
原理：干燥、缺氧

方法：取河砂若干，24目过筛10%HCl浸泡24h水洗至中性烘干后分装安瓿瓶或试管，加棉塞灭菌无菌检查每管加孢子悬液，接种环拌匀干燥器中干燥火焰熔封或蜡封干燥器中保藏
说明：
适于保藏霉菌和放线菌孢子及芽孢杆菌
时间2—10年
4、液氮超低温保藏法（冷冻保藏法）
原理：低温

方法：将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196℃）。

优点：适用于各种微生物的较理想的保藏方法。
缺点：专门的设备；运输过程比较麻烦；操作要求5、真空冷冻干燥法
原理：低温、干燥、真空（缺氧）
方法：将菌种用保护剂制成菌悬液，先在极低温度下快速冷冻，再在极低的温度下抽真空干燥，使其中的水分直接升华为水蒸汽，以达干燥的目的。
常用的细胞保护剂：血清、脱脂牛奶、淀粉、葡聚糖

优点：适用各种微生物；便于大量保藏；可避免污染
变异率低；菌种存活时间长（几到几十年）
缺点：操作过程复杂，需要一定的专业设备
几种常用菌种保藏方法的比较菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。

菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)
美国的典型菌种保藏中心(ATCC)
英国国家典型菌种保藏所（NCTC）
法国里昂巴斯德研究所（IPL）
七、菌种的衰退与复壮2、衰退的原因
①基因突变，②分离现象

4、菌种的复壮（rejuvenation）
使衰退的菌种恢复原来优良性状。
狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌