黄芩苷对小鼠哮喘模型的炎性细胞的影响.doc

黄芩苷对小鼠哮喘模型的炎性细胞的影响
试验设计
试验材料：
试验动物：健康BALB/c小鼠60只，雌性，6-8周龄，体重18-22g。小鼠随机分成6组：正常对照组、模型组、地塞米松阳性对照组及黄芩苷高、中、低剂量组。
试验试剂：黄芩苷、卵清蛋白（OVA）、氢氧化铝凝胶、地塞米松、小鼠TL-4、IL-5、.1L-13、IL-17、IFN-γ细胞因子和小鼠抗OVA-IgEELISA试剂盒、脂多糖（LPS）、过碘酸—雪夫反应试剂盒、RT-PCR试剂盒、乙酰甲胆碱等
主要仪器：
试验方法：
建模：
①嗜酸性粒细胞性哮喘模型模型组、阳性对照组及黄芩苷高、中、低剂量组小鼠分别于第1、7、15天腹腔注射OVA溶液0.2mL(含OVA20μｇ、氢氧化铝1ｍｇ),于实验第21天起将小鼠置于密闭容器内,予2%OVA生理盐水雾化激发,1次/天,每次30min,连续7ｄ,以呼吸急促深快、烦躁呛咳及点头运动等症状的出现为激发成功;正常对照组:于第1、7、15天以生理盐水代替OVA溶液给小鼠腹腔注射(0.2ｍＬ),第21天起以生理盐水进行雾化激发。其余同前。
②中性粒细胞性哮喘模型
小鼠致敏：于实验第1天、7天和15天分别致敏，共三次。方法：每只小鼠用1%戊巴比妥钠溶液50mg/kg腹腔内注射麻醉后，使其颈部竖直，用移液器取10μgLPS经鼻逐滴滴入，利用小鼠呼吸将致敏液吸入气道，左右鼻孔交替进行并于腹腔内注入OVA50μg。
小鼠激发：从实验第21天起，将哮喘组小鼠置于自制小鼠雾化吸入箱中，用5%OVA溶液进行雾化吸入激发，每天雾化30min，连续雾化2周
给药方法：自实验第21天起,在OVA溶液雾化攻击前1ｈ给予相应药物。黄芩苷高、中、低剂量组分别灌胃给予黄芩苷90、30、10mg/kg(灌胃容积25ml/kg);阳性对照组小鼠灌胃给予地塞米松1.0mg/kg;正常对照组、模型组小鼠灌胃等容积生理盐水,连续7ｄ(于第28天,即末次激发后24ｈ处死小鼠)。
标本收集：
小鼠血清：末次激发后24h,小鼠经眼球采血。全血37℃静置2h,4℃过夜,3000rpm离心l0min。收集血清样本,用于测定血清中抗OVA特异性IgE表达水平。
肺泡支气管灌洗液：末次激发后24h,将小鼠麻醉腹部向上固定于蛙板,剪开皮肤,剥离气管,用眼科剪将气管剪适中小口,用磨平的15号针头做气管插管,将线绳穿过气管底部,固定气管与针头。将0.5mL37℃生理盐水缓慢注入其中,轻轻按压胸部,然后回收置于离心管中,重复2次,使其回收率达80%。合并3次灌洗液。
BALF中细胞因子测定：将BALF1500rpm离心10min,取上清液测定BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IFN-γ表达水平。按ELISA试剂盒说明书进行测定。
BALF中炎性细胞总数和分类计数：将BALF离心后细胞泥悬浮于1mLPBS,吸取20μL涂片、干燥、固定,进行瑞士-姬姆萨染色,每板至少200个细胞。根据形态学特征进行分类计数,炎性细胞总数、嗜酸性粒细胞(EOS)、中性粒细胞（NEU）和巨噬细胞。
肺病理组织切片的制作:末次激发后24h,小鼠眼球放血处死,剪小鼠皮肤,剖开胸腔,取出肺脏。将小鼠肺脏浸入10%福尔马林固定,修整组织块,常规石蜡包埋切片,进行HE染色,镜检观察。过碘酸雪夫氏(AB-PAS)染色观察黄芩苷作用后,哮喘模型小鼠肺部病理学变化。
RT-PCR:
引物设计及合成Ｔ-ｂｅｔ,上游,5′-ＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＧＣＴＴＡＴＡＴＧ-3′,下游,5′-ＧＡＣＧＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＣＡＣＡＴＴＧＴ-3′,扩增产物136ｂｐ;ＧＡＴＡ-3,5′-ＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＧＣＴＡＡＴＧＧ-3′,下游,5′-ＧＡＡＣＴＣＴＴＣＧＣＡＣＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＣ-3′,扩增产物408ｂｐ;ＳＴＡＴ-6,上游,5′-ＣＡＣＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＣＴＡＴ-3′,下游,5′-ＣＴＧＡＡＴＣＣＴＴＡＡＣＡＧＡＡＣＣ-3′,扩增产物361ｂｐ;β-ａｃｔｉｎ,上游,5′-ＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣ-3′,下游,5′-ＣＡＣＧＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧ-3′,扩增产物491ｂｐ。
趋化因子：Th1：CXCR3、CCR5
Th2：CCR3、CCR4、CCR8
气道阻力、AHR测定:于雾化第1、7、14天釆用Buxco小鼠肺功能仪(FinePointeTMSeriesRCSite)检测小鼠总气道阻力。l%OVA雾化完毕后立即予1%戊巴比妥钠60mg/kg麻醉小鼠,切开皮肤,钝性分离皮下组织、肌肉,充分暴露气管,眼科剪剪开一个小口,取18GBuxco小鼠气管插管置入气管中行有创气管插管术;预热加热板至37℃,连接小鼠肺功能测量仪,将小鼠置于密体描恒温箱加热板上,呼吸机辅助呼吸