OD值的测定.doc

根据测OD时光的波长，波长在紫外范围就能够测，如果不在，就不能测量。非常感谢细履平沙.哪位能说的具体一点啊,我想测枯草芽孢杆菌的OD,我不太知道是在多少nm下测,我看过一些文献,上面说细菌大概600nm,还是我自己摸索吸收波长啊?另外是测吸光度还是透光率啊,空白用培养基做吗.请高人指点,谢谢了.一般测菌体密度的OD的波长范围是580nm-660nm我们哪会儿测的(枯草芽孢杆菌)用600nm,已经属于可见光区空白如用水做,需要离心洗涤菌体,空白如用不接种的培养基做就不需要洗涤,但是不接种的培养基要和接种的同时培养,以求条件一致最后注意如果OD大于2.0,一般要稀释后再测,因为OD太大了,分光光度计的灵敏度就会显著降低一般都测吸光值，而且最好是整个实验过程中，保持发酵液或菌体的稀释倍数一致，吸光值与稀释倍数不一定成正比，可保证整个实验点有可比性一般OD值在控制在0.1-0.4最好，在这个区内的值就可靠，最好不要超过1.0取值的时候要连续读数，重复3次的数最好。测菌体密度的OD的波长可以自己摸出来，看看用哪个波长有最大吸收就可以了。有合适的现场用的分光光度计推荐吗？要求只用作菌浓的OD值测定，哪种最便宜的分光光度计可以选择？DNA合成常见问题及解答Q:怎样对合成DNA制品进行定量?A:DNA的量与260nm处的吸光度值（OD值）成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的。1个OD值的合成DNA的重量约为33mg。Q:怎样理解测定的OD值?A:进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。当测定200ml溶液中的OD值为1.5时，溶液整体的OD量应该为多少？此时的OD值=1.5OD/ml×0.2l=0.3OD。Q:合成OligoDNA应怎样保存?A:保存合成的Oligo应该注意以下几点：1.干燥制品很稳定，常温下数个月无问题。但为保证万无一失，放置于-20℃保存为好。2.溶解后的溶液DNA短期内（1-2周）使用可放置在4℃下保存，长期保存请放置于-20℃。溶解DNA时，请注意使用无菌、无核酸酶的水或TEBuffer。3.荧光标记引物请避光保存。Q:合成DNA溶液在室温下放置了数天，还可以使用吗?A:溶液中的OligoDNA常温下数天（3-4天）应该没问题，但最好不要放置一个星期以上。其寿命受溶液中的菌体、核酸酶等的影响。Q:制品溶解后发现有少许沉淀，会影响实验结果吗?A:所有的制品纯化后都要进行脱盐，脱盐是使用C18柱进行的，偶而会有微量的树脂溢出而进入制品。树脂不影响任何反应结果，请稍许离心后取上清使用。Q:测定了制品的OD值后发现A260/A280<1.8，制品质量（纯度）合格吗?A:OligoDNA和一般提取的双链DNA不同，A260/A280的比值不能准确衡量OligoDNA制品的质量，该比值依赖于序列中的各种碱基的组份，下表中列出了不同碱基组成的20mer的OligoDNA的A260/A280比值。因此，如果您测定了A260/A280的比值小于1.8时，是由于上述原因引起的。Q:为什么PAGE级和高纯度级制品的提供量比其他公司少?A:无论是PAGE纯化，还是HPLC纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在2OD左右。大OD量的提供对提高纯度是不现实，不科学的做法。一般，1OD的20mer的DNA制品(约5nmol)，可以进行200-400次的PCR反应(50ml体系)，以及1,400次的测序反应。因此，2OD的DNA量可以足够进行一般的实验工作。Q:我公司的DNA制品包装中为什么不提供电泳照片?A:进行过OligoDNAPAGE电泳的人员都知道，同一OD量的不同序列的DNA制品电泳时的泳带亮度（清晰度）是不一样的。原因在于EtBr等染色剂的染色是渗透至DNA的双链之间的，而合成的OligoDNA是单链，OligoDNA自身形成的立体结构越复杂，EtBr的染色就越容易，DNA带也就越亮。相反，有一些OligoDNA由于不形成立体结构，根本就不为EtBr所染色。因此，我们认为有些公司对所有产品都提供差不多同一亮度的制品的电泳照片是非常不现实的做法。Q:使用3%的Agarose凝胶电泳合成OligoDNA制品，发现有很多条泳带，为什么?A:OligoDNA的电泳一定要使用变性PAGE电泳。OligoDNA是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带（更无法用Agarose电泳进行定量了)。Q:进行PAGE电泳时，长度完全一样的OligoDNA为什么泳带不在同一位置?A:我们分析后认为主要有以下原因：1.A、G、C、T的组份不同，电泳速度不同；2.DNA的立体结构不同，电泳速度不同。这种情况在OligoDNA越短