产淀粉酶芽孢杆菌的分离筛选及发酵.ppt

河北化工医药职业技术学院实训名称一、实训目的

1、掌握培养基的配制方法和菌种的分离技术。
2、掌握各级种子制备技术。
3、了解培养基和空气系统的灭菌原理，掌握灭菌技术。
4、熟悉和掌握接种操作。
5、了解小型发酵罐的基本结构，掌握发酵罐的使用方
法。
6、熟悉和掌握常用的比色分析技术。
7、了解细菌培养过程的代谢变化。1.产淀粉酶芽孢杆菌初筛

1.1实验材料：

1.1.1样品：取自河北化工医药职业技术学院草坪内的土壤

1.1.2仪器(型号)：回转式恒温摇床、数显电热培养箱、超净台、立式压力蒸汽灭菌器、恒温水浴锅、试管、培养皿、锥形瓶、接种环、移液管、枪头、玻璃珠、涂布器

1.1.3培养基：淀粉培养基（1000ml蒸馏水、淀粉2g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、Nacl5g、琼脂2%、PH7.2注：淀粉应先用冷水溶解，再放入沸水中；先调PH，再分装。）
1.2实验方法
1.2.1菌种的分离与筛选
涂布分离:a.将5g样品放入盛有45ml无菌水
的锥形瓶中（先冷却无菌水，
再放入样品)，放入摇床振荡摇
匀10min，再放入水浴锅15min。
b.在培养皿中倒入培养基（量：15-20ml）
c.梯度稀释：d.涂步分离：分别取10-3、10-4、10-5的土壤悬液0.1ml用涂布器进行涂布分离

e.进行培养：放入数显电热恒温培养箱37摄氏度下培养
分区划线:取出涂布培养好的培养皿，选择不同形态较好的单菌落进行分区划线(做平行样)，原平皿加点液，观察透明圈大小

点接培养：分别用枪头分别蘸取菌种，点接在平皿中，做平
行样，至于恒温培养箱培养。

碘液显色:将划线过的菌种滴加碘液，观察透明圈大小；再进行显微观察（革兰氏染色；芽孢染色）1.2.1形态观察
革兰氏染色:
革兰氏染色操作步骤:
初染将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。
媒染滴加碘液冲去水迹，再染1-2min，水洗。
脱色吸水纸吸去多余水分,滴加95%乙醇，脱色20-30s立即水洗，以终止脱色。
复染吸水纸吸去多余水分,滴加番红，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。
干燥后，置显微镜下观察。
被染成蓝紫色者即为革兰氏阳性菌(G+)
被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)

芽孢染色：
（1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆
菌，作涂片、干燥、固定。
（2）滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。
（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但
勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。
加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。这
一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约
7．6％）染10分钟。
（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为
止。
（5）用番红水溶液复染1分钟，水洗。
（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。

编号编号菌号菌号分区划线结果挑选菌种碘液显色2、产淀粉酶芽孢杆菌的复筛
2.2.1实验材料
2.1.1样品:初筛获得的菌株
2.1.2仪器：台式离心机、分光光度计、膜过滤器、EP管、移液
枪、牛津杯等
2.1.3培养基：淀粉检测培养基：淀粉2g、蒸馏水1000ml、琼脂
2%、PH7.2
2.1.4试剂：
DNS试剂：称取3.25gDNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入500ml容
量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液162.5ml，再加22.5ml
丙三醇，摇匀，冷却后定容至500ml
葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖22mg，加入少量蒸馏
水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖2.0mg/ml
1%淀粉溶液
2.2实验方法
2.2.1菌株的液体培养

2.2.2酶活测定
（1）平板扩散法
打孔法：
将培养皿中倒入培养基，待其固定后，用枪头打孔，然后用移液枪接入用膜过滤器过滤后的发酵液100ul，放入恒温培养箱中培养。

牛津杯法：将培养皿中倒入培养基，待其固定后，把牛津杯用镊子放入培养基中，轻轻按压固定，然后用移液枪接入接入用膜过滤器过滤后的发酵液100ul，放入恒温培养箱中培养。

注意事项：a.不要手摸过滤器底部；
b.过滤器要拧紧再过滤发酵液；
c.培养基薄厚、孔径大小、装液量要一致；
d.培养是正置培养。
（2）DNS法测定淀粉酶活力
葡萄糖标准曲线的制作
取试管若干，按照下表加入2.0mol/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光