分离产淀粉酶的芽孢杆菌.doc

从环境中分离产淀粉酶的芽孢杆菌
一、摘要
本文通过对土壤中细菌杀灭营养体芽孢萌发，并用由淀粉充当碳源的选择培养基培养分离，纯培养后通过镜检最后得到能产胞外淀粉酶的芽孢杆菌。
二、实验目的及要求
1、通过本实验的学习，使学生学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法；
2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定、染色观察等实验技能，对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练；
3、培养学生综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。
4、要求学生根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株并对其进行初步的鉴定。
三、实验仪器设备
主要仪器：超净工作台、生化培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、显微镜、培养接种器具等
主要制剂：富集培养基、选择性培养基、5%的番红水溶液、卢戈氏碘液
四、实验方案设计
（一）实验原理
1、土壤中含有各种微生物，其中产胞外淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，生物在适宜的的环境下生存得好，所以在淀粉厂附近的土壤中，能利用淀粉的微生物含量较高。
2、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。
3、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产保外淀粉酶利用淀粉的的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产胞外淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。
4、菌体可经简单染色后在显微镜下被判断出是否为杆菌
5、在含有淀粉鉴定培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色
（二）培养基成分
蛋白胨5g
NaCl5g
可溶性淀粉16g
蒸馏水1000ml
琼脂20g
（葡萄糖1.5g芽孢萌发时加葡萄糖以利生长）
五、实验内容及步骤
（一）产淀粉酶菌株的分离
1．样本采集
在花园土壤肥沃处采取土样，取25g加入225ml无菌水制成土壤混悬液。
2．目的菌株的富集
①在土壤混悬液中加入4g的可溶性淀粉，蛋白胨1.25g，NaCl1.25g，在37摄氏度摇床培养箱中培养3天，使菌体产生大量芽孢。在85℃-90℃水浴锅中加热15分钟，杀灭菌体，使芽孢得到富集。
②向灭菌后的土壤菌悬液中加入0.35g的葡萄糖，4g的可溶性淀粉，蛋白胨1.25g，NaCl1.25g，在37摄氏度摇床培养箱中培养3天，在85℃-90℃水浴锅中加热15分钟，杀灭菌体，得到芽孢体量增加。
3.选择性分离
①分别取制得混悬液取0.15ml均匀涂布在六个含葡萄糖的淀粉培养基上，在37摄氏度左右培养1天，平板培养基表面便形成了若干分散的单菌落。
②取其中三个平板用卢戈氏碘液检测，根据有无淀粉水解圈来判断其有产胞外淀粉酶能力，观察水解圈大小及菌落特征。
4．纯培养
在另三块平板上挑取与判断具产胞外淀粉酶能力菌的菌落特征相同的菌落点接到两个淀粉平板上的相同位置上。在37摄氏度培养1天。
（二）菌株的初步鉴定
培养后观察各菌落形态特征
取其中一块板分别滴加碘液，观察淀粉水解圈。
挑取对照板菌落通过简单染色制片观察，判别所选菌落是否为芽孢杆菌。
六、结果与讨论
（一）产淀粉酶菌株的分离
1．样本采集
分离目的菌株具有产胞外淀粉酶的生理特性，故采样地点应针对性的选取淀粉厂等淀粉含量高地区附近的土壤，在花园肥沃的土壤中采样会有大量可产胞外淀粉酶的芽孢杆菌，但是菌种及产胞外淀粉酶能力没有淀粉产附近好。
2．目的菌株的富集
培养后土壤悬浊液更加混浊并有难闻气味
3.选择性分离
①观察三个喷洒碘液的平板，根据产生水解圈大小及透明程度鉴定产胞外淀粉酶能力；水解圈越大越明显其产胞外淀粉酶能力越强，反之越弱。
②划线要比涂布效果好。
4．纯培养
对应点种：选取的目的菌株在两个平板相同位置点种，培养后其中一个滴加碘液出现水解圈
菌落特征：1、菌落圆形较大，扁平，表面较干燥，边缘不规则。
2、菌落圆形大，扁平，表面较干燥，边缘不规则。
（二）菌株的初步鉴定
长出的菌落典型，不含有杂菌，已达到纯化的目的不再重复分离
镜检
（三）实验中出现问题
实验中大锥形瓶剩余培养基及部分平板长出菌落，滴加碘液后出现水解圈，证明其有产胞外淀粉酶能力。
其菌落及制片观察
其菌落特征为：菌落圆形，枕状，较小，湿润粘稠（猜测具有荚膜结构），质地均匀易挑起。
剩余培养基在加塞大锥形瓶中存放，倒平板后未再打开，保存环境不是无菌环境。在镜检中并没有发现芽孢，出现水解圈但是不大。经分析，我认为此菌来源于空气。