黄嘌呤氧化酶法测定抗氧化能力.doc

发酵过程产物形成的测定(SOD活性的测定)
实验目的
了解SOD活性测定的原理
学习黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性
实验原理
原理：黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺成亚硝酸盐，亚硝酸盐在对氨基苯磺酸与甲萘胺作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性抑止作用，使可形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于空白管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中SOD的活力。操作步骤：如表2-1。
三、实验试剂
硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌呤氧化酶，醋酸等。
四、实验步骤
试剂测定管对照管75mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.8）0.550.55待测样品（ml）A(取样量)00.1mol/L盐酸羟胺溶液0.050.0575mmol/L黄嘌呤溶液0.050.050.037U/L黄嘌呤氧化酶0.050.05双蒸水0.2－A0.2用漩涡振荡器充分混匀，置37℃恒温水浴30min。显色剂（ml）11总体积1.9ml，混匀，室温放置10min，蒸馏水调零，测A530
五、计算方法
计算公式：每毫升反应液中SOD抑止率达50％时对应的SOD量为一个SOD活力单位（U），待测样品中的SOD活力由下式计算：
SOD抑制率（％）＝（A2-A1）/A2×100%
SOD活力（U/ml）＝（A2-A1）/A2×100%÷50％×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数
式中：A1:测定管的吸光值；A2:空白管的吸光值
六、注意事项：
1.试管要洗干净，在测定微量样品时尤为重要。
2.要做空白管，并且放在所有测试管的中间做，取平均值。
常用试剂
（1）诱导剂：分别配制IPTG100μmol/mL；CuSO4·5H2O250μm/mL；ZnSO4100μm/mL。分别于0.22μm滤膜过滤除菌。
（2）稀释菌体所用0.02mol/LpH7.4PBS缓冲液：8.5gNaCl，0.2gKCl，Na2HPO4·12H2O，3.628g，0.27gKH2PO4，定容至1000ml。
（3）SOD活性测定
①75mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.8）母液配制：A：0.15mol/LK2HPO4配置：准确称取17.115gK2HPO4·3H2O溶于500mL蒸馏水中。B：0.15mol/LKH2PO4配置：准确称取2.041gKH2PO4溶于100mL蒸馏水中。取母液A91.5mL与母液B8.5mL充分混合后，用水稀释至终体积200mL，用酸或碱调pH至7.8。
②0.1mol/L盐酸羟胺溶液（要求新鲜配置）准确称取6.949g盐酸羟胺溶解于1ml蒸馏水中。
③75mmol/L黄嘌呤溶液（要求新鲜配置）准确称取11.41g黄嘌呤溶于1mlNaOH稀释液中。NaOH备用液：称0.8gNaOH溶于50ml水中，使用时稀释3倍为0.133mol/LNaOH稀释液。
④0.037U/L黄嘌呤氧化酶溶液（要求新鲜配置，避光）
⑤显色剂配制（避光保存）：
A:量取冰醋酸172.5ml于500ml棕色瓶中，称取0.2g甲萘胺加入冰醋酸中。
B：称取2g对氨基苯磺酸溶于100ml蒸馏水中(对氨基苯磺酸不易溶解，在棕色瓶里用超声波处理，水温60－70℃)。
C：待对氨基苯磺酸完全溶解后与冰醋酸混合，加蒸馏水至终体积500ml。