核酸分子杂交.ppt

获得、检测和筛选目的基因的主要方法之一
核酸分子杂交：（nucleicacidmolecularhybridization）检测对象:克隆化的基因组DNA,、细胞总DNA、总RNA。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交,即细胞原位杂交。Content第一节核酸分子杂交的基本原理如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合适标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe),与变性后的单链基因组DNA或RNA进行杂交。
再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表达丰度等。Tm：50%DNA解链的温度，又称融解温度。
（G、C含量）Tm=69.3+0.41*(G+C)%第二节核酸探针探针的种类（1）理想的标记物应具备的特性：
敏感度高；
特异性强；
不影响探针分子的主要理化特性；
标记、检测方法简单、探针保存时间长；
对环境无污染、对人体无损害；
价格低廉
（2）标记物种类：放射性标记物
非放射性标记物常用的探针标记法：（1）化学标记法：通过分子上的活性基团直接将标记物结合到核酸分子上.（2）酶促标记法：
将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的
方法将标记物掺入到探针分子上。
缺口平移法、随机引物法、末端标记法等①缺口平移法
由DNA酶Ⅰ和大肠
杆菌DNA聚合酶Ⅰ
共同完成。最合适的缺口平移片段一般为50-500个核苷酸。
DNA酶Ⅰ的用量和E.coliDNA聚合酶Ⅰ的质量会影响产物片段的大小。
DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA。②随机引物法（randompriming）产物平均长度为400-600个核苷酸。
Klenow片段没有5’→3’外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。
反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。③探针的末端标记：在5’或3’端通过酶促反应加上标记物核酸探针检测方法非放射性标记探针：偶联反应+显色反应第三节核酸分子杂交技术Ⅰ膜固相印迹杂交固相支持物的选择（１）硝酸纤维素膜：在低离子强度下，很强的吸附单链、双链的DNA或RNA；350-500ug/cm2（3）PVDF膜（聚二氟乙烯）：Ⅱ杂交的基本过程（１）变性（Denaturation)（2）杂交（hybridization)影响杂交的因素（３）洗膜（4）杂交信号的检测Ⅰ-3膜固相杂交的类型Thankyou！