载体构建步骤.doc

载体酶切线性化（TOYOBOEcoRI）1.载体pCDNA浓度0.8ug/ul2.酶切体系（总50ul体系）pCDNA3ul10*HBuffer5ulddH2O41ulEcoRI1ul（8U/ul）3.反应条件37°C1h至多2h*已经试过37°C过夜，本以为会酶切充分，但是不想把条带全切成小片段了，而且电泳后是一条宽宽的泳谱*另外，多次酶切证实，所加的酶量过多在酶切一小时的情况下仍然会出现酶切过度的情况，尽可能按照说明书上的量和时间做
取2ul稀释成5ul于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定有无条带及大小用大凝胶回收pcDNA（按2.5：1加入SYBRGreen）电泳30min准备两支EPPendorf管，调60°C水浴锅切胶称重（1.5mlEPPendorf管重约0.82g）
OMEGAgelpurificationkit回收pcDNA1.平衡柱子加200ulBufferGPS到DNA收集柱中，静置4min，12000xg*2min，加700ulDEPC处理H2O，12000xg*2min2.溶胶按1ml/kg的比例加BindingBuffer到凝胶中3.60°C水浴7mins，迅速转移至DNA收集柱中（至多700ul，超过的再转移一次），10000xg*1min，弃收集管中的液体4.加300ulBindingBuffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体5.加700ulwashBuffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体6.加350ulwashBuffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体7.最大转速（>13000rpm）空转2min，弃收集管8.转移收集柱至1.5mlEPPendorf管，打开盖子静置2min9.加30ulElutionBuffer静置2min，最大转速1.5min，弃收集柱10.取2ul稀释成5ul点胶*所加ElutionBuffer的量是根据所纯化的产物的量来判断的，如果回收产物较多可以增加其量至50ul*纯化的理论效率为70%，如果先加一次ElutionBuffer20ul，静置2min，1000xg*1min,然后再加一次ElutionBuffer20ul，静置离心。这样回收效率可以达到90%，不过终浓度会变稀
去磷酸化处理（TOYOBOBAP）1.反应体系（总200ul）DNA5-20pmoles
10*Buffer20ul
BAP2U（0.5U/ul）
ddH2OUpto200ul*做去p之前，必须得将之前的纯化物点胶以确信是否有完整的DNA，我已经在这个问题上吃过三次亏了，谨记！！！2.反应条件：37°C60min（5’黏末端）60°C60min（3’黏末端，平末端）
OMEGAgelpurificationkit回收去P处理过后的pcDNA，步骤同前，测浓度
连接（Invitrogen-T4DNAligase）1.体系：5*Buffer4ul插入片段9-90fmol载体3-30fmolddH2Oupto19ulT4DNAligase1ul*pcDNA片段大小5400bp，取载体终浓度为30fmol，则所需质量为30*10-15*660*5400g=0.1ug，所需插入片段的质量为0.1ug*3*基因bp数/5400=0.00556*bp数/1002.条件：粘性末端23-26°C>1h（推荐）或者16°C过夜平末端14°C24h3.终止：加1ul0.5MEDTA，可保存于4°C4.取部分反应产物稀释5倍用于转化感受态细胞*3,4步可省略，转化时直接取产物2-3ul加入20-25ulToP10转化*连接可以短时保存于4度，但是不宜久，当天的连接产物当天需转化*然后童教授推荐的加样量计算方法是：按照纯化物和pcDNA电泳图中亮度的比例来定，比如：3000和pcDNA的亮度比为1：1，为使插入片段和载体的终浓度（mol）比为4-10：1，则基因bp数基因：pcDNA（mol比）加样比（ul比）30001590(1/1590):(1/5400)=3.4mol:1mol2-3ul：1ul为使转化的量较多，可以成倍加样，但是DNA终浓度过高会影响连接效率已经酶活性
转化*开冰箱取TOP10前需做好其他相应的准备取一定量连接产物所加Top10的1-2%至1.5mlEPPendorf管中，20-200ul吸样枪，1-10ul吸样枪，EP管架，冰盒，计时器。1.取TOP10（一只TOP10为100ul装，可转化2-5样），计时5min2.分装20-50ul刚解冻的TOP10至各含有连接产物的EP管中3.冰浴20-30分钟*准备42°C水浴锅*取出不含Amp的LB培养基平衡至室温*取含Amp的LB培养皿放至37°C恒温培养箱（需做蓝白斑筛选的需要在平衡至室温后加入16ul50ug/u