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表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基

因载体。

一个合格质粒的组成要素：

（1）复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有

一个复制起始点。而

真核生物DNA分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+,Kan+

（3）多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段

（4）P/E启动子/增强子

（5）Terms终止信号

（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如

果构建的目

的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表

达载体。
【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb选

质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达

真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为

相应载体的参考。

【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与

载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：

（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝

数也多（也有大载

体）；

（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而

严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；

（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一

试）。

（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否

需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体

DNA进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。
如何阅读质粒图谱

第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）

第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。

（1）Ampr水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。

（2）tetr可以阻止四环素进入细胞。

（3）camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活

（5）hygr使潮霉素β失活。

第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基

因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的

失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源

DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率

越低。

第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录

终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控

有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。

第六步：启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号

（1）启动子－促进DNA转录的DNA序列，这个DNA区域常在基因或操

纵子编码序列的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始

转录的部位，但启动子本身不被转录。

（2）增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强
邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所

调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。

（3）核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖

体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。

（4）转录终止序列（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中

有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰

区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有

一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，