ITS菌种鉴定方 法.doc

利用ITS进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。ITS是内源转录间隔区(InternallyTranscribedSpacer)的英文缩写,位于rRNA编码基因18S,5.8S和28S之间的小基因片段。其优点有:具有高拷贝数,整个序列的长度在600～800bp，利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；同时包含保守与变异序列,能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，rRNA基因(rDNA)在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。这些rDNA高度保守地分布在染色体的不同位置，在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个,这使得保守区域能够很容易被扩增出来。每个重复的rDNA序列的存在方式为由一前一后的18SrDNA小亚基单元(SSU),5.8SrDNA,28SrDNA大亚基单元(LSU)组成,已设计出通用引物来扩增ITS序列分析相关真菌种水平之间的差异。本研究通过丝状真菌ITS保守序列的扩增,同源序列的对比分析,结合传统鉴定方法,对从土壤中分离筛选的一株丝状真菌进行了分析鉴定,并对鉴定结果和方法进行了比较分析。种内变异还显示在rDNA基因间内转录间隔区Ⅰ和Ⅱ（分别为ITSⅠ和ITSⅡ）的片段大小上。ITS区在核糖DNA中进化较快，可在同一属间甚至群体间发生变化。其中ITSⅡ区在种间变异性较高（22％），种内变异性较低（＜3％）。选择的两对引物均以ITS区的序列为靶目标，其中引物①（ITS1和ITS4）扩增的是ITSⅠ区、5.8SrDNA和ITSⅡ区的基因序列，可以鉴别出念珠菌属的3个菌种；引物②（ITS4和ITS86）扩增的是5.8SrDNA和28SrDNA之间的ITSⅡ区的保守顺序，可以鉴别出念珠菌属的7个菌种。因而笔者更推荐采用引物②，它不仅有很强的通用性，能识别更多菌种，而且具有更高的属种特异性。

1、通用引物①：
ITS15'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG一3’
ITS45'-TCCTCCGCTTATTGATATGC一3’
通用引物②
ITS45'-TCCTCCGCTTATTGATATGC一3’
ITS865'-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC一3’