2020113383178一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法.pdf

(19)国家知识产权局

(12)发明专利

(10)授权公告号CN112505179B
(45)授权公告日2022.08.16
(21)申请号202011338317.8(56)对比文件
(22)申请日2020.11.25US2017202802A1,2017.07.20
CN106442838A,2017.02.22
(65)同一申请的已公布的文献号CN110542735A,2019.12.06
申请公布号CN112505179A彭絮等.同位素稀释液相色谱串联质谱法测
(43)申请公布日2021.03.16定人血清中5-甲基四氢叶酸《.临床检验杂志》
(73)专利权人重庆大学附属肿瘤医院.2018,第36卷(第03期),161-165.
地址400030重庆市沙坪坝区汉渝路181号Jayasheela,Mary等.Drugutilization
patterninpregnantwomeninatertiary
(72)发明人何永鹏李咏生单娟娟李丽仙carehospital,Hyderabad,Telangana.
张海伟李佳涛赵化侃王梦竹《JournalofChemicalandPharmaceutical
(74)专利代理机构重庆信航知识产权代理有限Research》.2015,第7卷(第7期),184-188.
公司50218审查员徐心田
专利代理师穆祥维

(51)Int.Cl.
G01N30/02(2006.01)
G01N30/14(2006.01)权利要求书2页说明书8页附图2页
(54)发明名称
一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱
联用方法
(57)摘要
本发明公开了一种测定同位素稀释超高效
液相色谱质谱联用方法，步骤如下：1)选取三种
目标化合物：吡哆醛；5‑甲基四氢叶酸；甲钴胺；
2)以目标化合物与其同位素内标的浓度比为X
轴，目标化合物与其同位素内标的峰面积比为Y
轴，建立校正曲线，计算上述三种水溶性维生素
的含量；3)蛋白沉淀剂配制；4)血清样本的前处
理；5)标准曲线的配制与处理。运用蛋白沉淀与
液液萃取相结合的前处理方式对血清样本处理，
一方面使样本中蛋白质变性沉降得以去除，另一
方面脂类杂质得到去除，使处理后的样本在检测
过程中受较少基质的干扰；运用相对简便的前处
理方式，及快速的检测方法，建立一种能同时检
测多种水溶性维生素代谢产物。
CN112505179B
CN112505179B权利要求书1/2页

1.一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，其特征在于，该方法包括如下
步骤：
1)选取三种目标化合物
三种目标化合物分别为：吡哆醛；5‑甲基四氢叶酸；甲钴胺；
2)利用同位素内标法进行定量，以目标化合物与其同位素内标的浓度比为X轴，目标化
合物与其同位素内标的峰面积比为Y轴，建立校正曲线，计算上述三种水溶性维生素的含
量；
3)蛋白沉淀剂按照如下方法配制得到：分别移取10μL100μg/mL吡哆醛‑d3、10μL100μ
g/mL5‑甲基四氢叶酸‑d5、20μL10μg/mL甲钴胺‑d3，加甲醇定容至1mL，配制成混合内标
液，再准确移取100μL混合内标液，用50％甲醇乙腈定容至10mL，配制成内标浓度分别为
10.0ng/mL吡哆醛‑d3、10.0ng/mL5‑甲基四氢叶酸‑d5、2.0ng/mL甲钴胺‑d3蛋白沉淀剂；
4)血清样本的前处理：
4.1)准确移取200μL血清样本，加入含有三种内标的蛋白沉淀剂500μL，涡旋混匀3min，
再加入600μL80％正己烷/乙酸乙酯，v/v，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心10min；
4.2)取中间层500μL置于新的1.5mLEP管中，避光氮吹30min至近干，再加入溶剂溶解，
涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心2min；取100μL于96孔样品板中，上机检测；
5)标准曲线的配制与处理
5.1)分别准确称取10.0mg吡哆醛、10.0mg5‑甲基四氢叶酸、10.0mg氰钴胺、10.0mg甲
钴胺，分别加入10mL甲醇、10mL含1％VC甲醇，v/v、10mL甲醇、10mL甲醇，配制成浓度分别为
1.0mg/mL吡哆醛母液、1.0mg/mL5‑甲基四氢叶酸母液、1.0mg/mL氰钴胺母液、1.0mg/mL甲钴
胺母液；
5.2)分别移取100μL1.0mg/mL吡哆醛，用50％甲醇水定容至1mL得到100.0μg/mL吡哆
醛中间液；移取100μL1.0mg/mL5‑甲基四氢叶酸，用甲醇定容至1mL得到100.0μg/mL5‑甲
基四氢叶酸中间液；移取10μL1.0mg/mL甲钴胺，用甲醇定容至1mL得到10.0μg/mL甲钴胺中
间液；
5.3)分别从上述吡哆醛中间液、5‑甲基四氢叶酸中间液、氰钴