基因克隆载体.ppt

基因克隆载体基因克隆载体的特点２克隆载体的分类2.2按克隆载体的用途分类第二节质粒克隆载体细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子
细胞外：超螺旋、开环，线形质粒DNA分子的大小:细菌质粒的大小相差较大，小的仅不足1kb，大的可达数百kb.

不相容性（Incompatible）：两种类似的但又不同的质粒不能存在于同一细胞中．

可转移性：质粒可通过接合作用等方式转移到新的宿主细胞中．

复制性：质粒DNA分子只在宿主细胞内进行单向复制，其复制受质粒本身和宿主细胞遗传系统的双重控制，质粒提供复制的起始位点和核苷酸的序列．质粒上的相关基因２几种常见的质粒载体2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和复制的起始点，部分缺失的Lac操纵子片段，并在LacZ’区组装了MCS．pUC18-19多克隆位点3）pBluescriptM13：含有M13噬菌体DNA复制起点的载体，该起点以互为相反方向插入到含有T3和T7噬菌体启动子的一个来自pUC质粒的载体当中．4）Ti质粒载体人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。1907年
Smith和Townsent等
首先发现这种冠瘿瘤
病是由根癌农杆菌
引发的。1、T-DNA区：转移DNA，农杆菌侵染细胞时，从Ti质
粒上切割下来转移到植物细胞上的一段DNA
2、Vir区：毒区，激活T-DNA转移。与T-DNA区相邻，
二者共占Ti质粒DNA的1/3。
3、Con区：接合转移编码区，该区存在着与细菌间接
合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在
农杆菌之间的转移。
4、Ori区：复制起始区
病毒区基因及功能Ti质粒T-DNA的边界序列３质粒载体的构建3.2pBR322质粒载体的构建３.3pUC18-19质粒载体的构建pUC18-19的构建筛选重组子的示意图利用菌落颜色筛选重组子3.４蓝藻质粒载体的构建蓝藻质粒载体pAQE17的构建3.５农杆菌Ti质粒载体的构建外源片段共整合到Ti质粒上的过程双向载体：由两个以上的质粒构建而成.将Ti质粒的Vir与广宿主范围质粒的携带目的基因(MCS)、选择性标记、转移和复制功能整合在一起.双向载体可在大肠杆菌和农杆菌中进行复制并稳定存在下去．第三节噬菌体衍生的克隆载体a)在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp)
在两端各有12个碱基组成的5’单链互补粘
性末端(Cohesiveend),进入宿主细胞后,
粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)．
5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’
XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’
b)λ基因组DNA上有多种限制酶识别位点．
c)λ噬菌体包装DNA的大小为原λDNA长度的
75-105%(38-54kb)．1.2λ基因组DNA的结构噬菌体的组装1.3λ噬菌体载体构建的策略常用的λ噬菌体衍生载体2.Cosmid克隆载体2.2部分Cosmid载体3.M13衍生的克隆载体3.2M13DNA的复制与M13噬菌体的增殖3.3M13衍生的克隆载体第四节植物病毒载体1）CaMV-DNA的一般特性花椰菜花斑病病毒DNA缺口的结构CaMVDNA分子上有八个开放阅读框（ORF)和三个间隔区．

ORFI：编码运动蛋白，负责CaMV在细胞间运转．
ORFII：表达产物与蚜虫口针或前肠的特殊位点
相结合，参与蚜虫的感染．
ORFIII：编码病毒结构蛋白．
ORFIV：编码外壳蛋白．
ORFV：编码逆转录酶．
ORFVI：宿主范围，病害的发生和症状的出现等密切相关。
ORFIII：功能不清楚．
ORFIV：功能不清楚．病毒增殖3)CaMVDNA的间隔区CaMV35S启动子序列4）CaMV-DNA限制性内切酶识别位点CaMV（CabbB-S）DNA的部分酶切位点5）CaMV-DNA的存在状态与感染能力6）CaMV的转录复制与CaMV的增殖7)CaMV-DNA克隆载体的构建互补载体系统混合载体系统2.烟草花叶病毒（TMV)克隆载体TMV的结构特征TMV克隆载体构建的策略475/476ALSV-RNA2(3385nt)接種葉第五节动物病毒基因克隆载体1)SV40DNA的一般特性
SV40DNA为环状双链DNA（5243bp），与宿主细胞组蛋白H4，H2A，H2B和H3结合，组成念珠状核小体-微型染色体（mini-chromosome）

SV40DNA编码两个基因区，早期转录区和晚期转录区，分别以相反的方向转录SV40基因转录图SV40DNA单识别位点限制性内切酶位点2）SV40-DNA的转录、复制与增殖3）SV40DNA衍生的克隆载体的构建SV40DNA晚期转录区取代型载体重组病毒质粒载体2.腺病毒克隆载体腺病毒结构腺病毒DNA的结构腺病毒克隆载体的构建第五节反转录病