单克隆抗体与基因工程抗体制备.ppt

多克隆抗体(Polyclonalantibody)单克隆抗体(Monoclonalantibody,McAb)杂交瘤技术的理论基础杂交瘤技术流程两种亲本细胞的选择与制备骨髓瘤细胞系选择要点：
稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63等。
保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）
防止支原体污染（胎牛血清）
融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％
一般要求：
与骨髓瘤细胞同源的小鼠（Balb/c小鼠）

8～12周龄

20g～25g体重用高纯度高活性抗原刺激免疫小鼠
免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。
可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）。冲击免疫（融合前3天进行）
颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果

细胞融合免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。
融合比例：
骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10
融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）
融合24小时后加HAT培养液2周后改用HT培养液2周后改用一般培养液
杂交瘤细胞的筛选与克隆化HAT选择培养基的原理抗原免疫的脾细胞小鼠骨髓瘤细胞（B细胞）（B细胞恶性肿瘤）1.抗体分泌（Ig+)具永生性2.HGPRT+在HAT生长PEG融合HAT筛选脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）（HGPRT+、Ig+）融合后不同细胞在HAT培养基的结果及命运阳性杂交瘤细胞的筛选克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。
克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次
克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法有限稀释法阳性杂交瘤细胞的冻存单克隆抗体的制备腹腔注射法单克隆抗体的纯化亲和层析法单克隆抗体的性质鉴定单克隆抗体特性单克隆抗体在医学中的应用基因工程抗体与抗体库技术嵌合抗体(chimericantibody)
从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。
特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
人源化抗体(humanizedantibody)
1.将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体。
2.将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体