基因克隆及克隆基因的表达.ppt

吉林大学白求恩医学院分子生物学教研室
讲师
孙巍
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2012-10荧光蛋白基因克隆猫
荧光蛋白基因克隆猫科学家复活冰冻死老鼠修正基因蚊子防控疾病基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛基因克隆胚芽造就健康婴儿94℃TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)72℃PCR引物设计的基本原则：PCR引物的设计实例克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖Targetgene转化（transformation）
质粒或黏粒→细菌
质粒→酵母（真核细胞）
转染（transfection）
外源DNA→真核细胞（酵母除外）
感染（infection）
噬菌体颗粒→细菌
病毒颗粒→哺乳细胞Recombinant
vector筛选出含有重组DNA(目的基因+载体)的克隆IPTGBluecolony如果外源基因插入位于LacZ基因内部的多克隆酶切位点，则不能通过α-互补编码β-半乳糖苷酶，菌落呈白色。ShortSummaryofgenecloning：Why？基因克隆技术亚克隆（Subcloning）原核表达系统
原核表达系统：
外源基因引入原核细胞，使其快
速高效表达基因产物。
真核表达系统：
外源基因引入真核细胞，使外源
基因在真核细胞中表达。第一部分.外源基因在原核细胞中的表达①生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。
②基因组结构简单，便于基因操作和分析。
③多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。
④生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。
⑤不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。
⑥内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。启动子原核表达载体的启动子都是可诱导的,目的是在需要目的蛋白的时候才表达它.Plac：受Lac阻遏蛋白负调节，
受IPTG的诱导。

PL启动子：噬菌体早期
左向启动子。ONNNAAGGAGGNNNNNAUGCAAAUUSD序列：影响翻译效率成熟型1）成熟型表达载体2)融合型表达载体第二种情况：Mostpopularprokaryoticexpressionplasmidwithhis-tag.融合蛋白3)分泌型表达载体CellwallTherecombinantproteinwillbesecretedintoperiplasm
避免目的蛋白被细菌蛋白酶降解
Thehighexpressionlevel
利于收集外源蛋白IPTGaddition外源基因在原核细胞表达的必要条件：
删除内含子和5’非编码区
外源基因置于强启动子和SD顺序控制下
维持正确开放阅读框架（ORF）
mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解
蛋白不需要翻译后加工过程真核基因在E.coli中表达应该如何构建？（2）尽量将密码子改变成E.coli偏爱密码子，如果有困难，可尝试将基因5’端前50个碱基变成偏爱密码子。Case2.HBsAg的表达真核表达系统的必要性及优势：
1.具转录后加工系统
2.具翻译后修饰系统，重组蛋白具有很好的活性
3.可实现真正的分泌表达
4.基因治疗、研究基因的功能等病毒基因组相对较大，不宜直接将外源基因克隆到病毒基因组。IsolatedrecombinantbacmidDNA
thentransfectinsectcellswithlipo-insect感染前三、哺乳动物细胞表达系统克隆基因的表达—获取重组蛋白ThankYou!AUG（91%）
GUG（8%）
UUG（1%）是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。具序列特异性、方向性、位置特异性、种属特异性。3.转录终止子大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。①必须是一种强启动子来自大肠杆菌的乳糖操纵子。缺乏蛋白质的加工。
（如糖基化、氨基酸修饰等）。