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基因克隆及蛋白表达.ppt

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基因克隆及蛋白表达研究某一目的基因功能一般策略第一部分PCR聚合酶链反应（PCR）技术一、PCR实验原理一、PCR实验原理二、PCR的反应体系二、PCR的反应体系二、PCR的反应体系TaqDNApolymeraseLATaqDNAPolymerasePyrobest&pfuDNAPolymerasePCR的反应体系三、基本操作步骤四、条件优化PCR反应液PCR反应条件五、PCR引物的设计引物设计的基本原则引物设计的基本原则引物设计的基本原则引物设计的基本原则引物设计的基本原则引物设计的基本原则引物设计的基本原则第二部分RT-PCRRT-PCRcDNA合成ReverseTranscriptaseReverseTranscriptaseRT-PCR用M-MuLV反转录酶（RNaseH-）进行cDNA第一链的合成用M-MuLV反转录酶（RNaseH-）进行cDNA第一链的合成cDNA第一链的合成有三个方法cDNA第一链的合成有三个方法cDNA第一链的合成有三个方法cDNA第一条链合成步骤第三部分克隆RNA提取纯化PCR片段回收T-A克隆转化感受态细胞转化感受态细胞T-Vector进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增第四部分：外源基因的原核表达外源基因的原核表达一、原核表达系统常用的载体及其应用大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统大肠杆菌载体的表达方式大肠杆菌载体的表达方式大肠杆菌载体的表达方式大肠杆菌载体的表达方式扩增阳性克隆并进行诱导表达SDS-PAGE电泳WesternBlotRNA提取纯化Northern印迹杂交是用于检测和量化细胞RNA的一种基本技术。它主要是将电泳凝胶中的RNA转移到尼龙膜上，通过紫外交联作用而使RNA与膜永久的结合在一起，固定在膜上的RNA样品与特异的探针杂交，从而对感兴趣的RNA进行定位。Northern印迹杂交Northern印迹杂交Northern印迹杂交Northern印迹杂交Northern印迹杂交Northern印迹杂交Northern印迹杂交Northern印迹杂交Northern印迹杂交Northern印迹杂交Northern印迹杂交Northern印迹杂交